microRNA實(shí)時(shí)定量PCR

               microRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)服務(wù)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，通過儀器對(duì)擴(kuò)增過程中每一個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量或定性的分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ弧㈧`敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。成熟microRNA是由21-25個(gè)核苷酸組成的小RNA，由于長度太短，不能通過傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。本公司通過特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及SYBR? Green熒光染料可以精確檢測(cè)微量樣品中microRNA表達(dá)水平。
本公司提供的microRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)服務(wù)具有以下特點(diǎn)：①高特異性——只對(duì)成熟MicroRNAs進(jìn)行定量，而不受其前體干擾；還可以在高度同源性的microRNAs之間進(jìn)行區(qū)分，在某些實(shí)驗(yàn)中甚至只有一個(gè)堿基的差異都能鑒別。②快速，簡單——整個(gè)操作只需兩步，不到3個(gè)小時(shí)，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。③靈敏——樣品消耗少，僅需1-10ng的total RNA或同等物；如此之高的靈敏度使得研究者可以用有限的樣品做更多的實(shí)驗(yàn)，比如做全套microRNAs表達(dá)譜研究。也有利于諸如干細(xì)胞，配對(duì)的人類腫瘤/健康對(duì)照等珍貴且很難獲得的樣品的節(jié)約使用。④超寬的線性范圍——可跨越7個(gè)數(shù)量級(jí)，這意味著研究者可以準(zhǔn)確的知道所用實(shí)驗(yàn)材料的每個(gè)細(xì)胞所含的目標(biāo)microRNA分子多還是少（這一點(diǎn)很重要，因?yàn)閙icroRNA的表達(dá)豐度在不同種類的細(xì)胞，組織以及疾病中變化范圍很大）。⑤具有很好的重復(fù)性，由不同的研究者操作時(shí)也能體現(xiàn)。
英拜生物為您提供microRNA 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)，您只需要提供保存完好的組織或細(xì)胞標(biāo)本，本公司專業(yè)的技術(shù)服務(wù)人員就可替您完成microRNA實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，提供給您完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，為您節(jié)省大量的時(shí)間和精力。
英拜生物microRNA實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)流程如下：

1. 引物設(shè)計(jì)、合成
   設(shè)計(jì)并合成目的microRNA的莖環(huán)RT引物、PCR引物。

2. 樣品RNA抽提
   a．組織樣品：取適量（50～100mg）新鮮組織或正確保存的組織樣品，勻漿后抽提RNA。
   b．細(xì)胞樣品：取1×106～1×107細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

3. RNA質(zhì)量檢測(cè)
   a．紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在波長260nm和280nm的吸收值，獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
   b．用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度和完整性。
   注：用于microRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的RNA樣品，必須高純度、完整，沒有RNase 污染（降解的樣品不能用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)），同時(shí)提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。

4. 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
   利用莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

5. 實(shí)時(shí)定量PCR
   以合成的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增（同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品中U6 snRNA含量作為內(nèi)參以校正上樣誤差）。

6. 分析結(jié)果、提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告
   分析實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中的目的microRNA。提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖表。