microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實(shí)驗
| 簡介： | microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實(shí)驗 |
| 提供商： | 上海英拜 |
| 服務(wù)名稱： | microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實(shí)驗 |
microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實(shí)驗 環(huán)狀RNA(circRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼RNA,不翻譯蛋白。但在細(xì)胞中它們能夠調(diào)控其他基因的表達(dá)變化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制。因此，通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究cirRNA、lncRNA的調(diào)控機(jī)制需要先找到與cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而熒光素酶報告基因?qū)嶒灴梢杂脕碜C明miRNA與circRNA, miRNA與lncRNA的直接相互作用。 英拜生物microRNA報告基因?qū)嶒灹鞒蹋?br/>1. microRNA靶點(diǎn)的預(yù)測 利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預(yù)測靶點(diǎn)序列。 2. 獲得microRNA靶點(diǎn)序列 根據(jù)提供的靶序列，合成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA模板。或者，設(shè)計引物PCR擴(kuò)增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全長序列或靶標(biāo)序列)。 3. cirRNA靶序列克隆 將合成的兩條單鏈退火成雙鏈（具有粘性末端），或?qū)CR產(chǎn)物雙酶切，后連入經(jīng)過同樣雙酶切的Psicheck-2載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。 4. 陽性克隆鑒定。 挑選轉(zhuǎn)化的菌落，PCR篩選含有插入片段的陽性克隆，測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。 5. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備 將psicheck-2報告基因載體、microRNA mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞。 6. 熒光素酶檢測 報告基因載體與microRNA mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞24-72h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測，確定目的microRNA的靶基因。 7. 整理分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。 提供有microRNA靶序列的報告基因質(zhì)粒、甘油保存菌株各一支。附實(shí)驗報告，包括載體構(gòu)建過程，鑒定記錄，測序報告，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，熒光檢測。   |
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