FISH原位雜交

FISH原位雜交

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microRNA原位雜交
   RNA原位核酸雜交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又稱RNA原位雜交(RNA in situ hybridization RISH)。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應(yīng)的RNA分子?，F(xiàn)在探針標記技術(shù)有生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。
   microRNA原位雜交實驗流程:

  • 組織預(yù)處理：冰凍切片、石蠟切片、細胞爬片等樣本取材、固定、切片。

  • 脫蠟：石蠟切片在乙醇、甲醛中脫蠟。

  • 蛋白k孵育

  • 原位雜交

  • 雜交后處理

  • 雜交后顯色


具體實驗操作步驟
1、脫蠟：
1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；
2）100％酒精兩次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，標記末段向下，空氣干燥。
2、蛋白酶處理:
1）每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脫水（-20℃預(yù)冷）。
3、變性：
1）每一個立式染色缸配制40ml變性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi)，每缸2min；
5）空氣干燥。
4、雜交：
1）準備探針；
2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；
4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。
雜交后的水洗：
5）鑷子小心去除蓋玻片；
6）43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測，勿使切片干燥。
檢測：
9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時處理4張切片。
10）每張切片使用30μl～60μl羅丹明抗-抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min；
11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
擴增：
12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；
15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
5、細胞核染色：
1）張切片加10μl～20μl DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml；
2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。


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