microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    環(huán)狀RNA(circRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)非編碼RNA,不翻譯蛋白。但在細(xì)胞中它們能夠調(diào)控其他基因的表達(dá)變化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，這一作用機(jī)制被稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制。因此，通過(guò)與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究cirRNA、lncRNA的調(diào)控機(jī)制需要先找到與cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可以用來(lái)證明miRNA與circRNA, miRNA與lncRNA的直接相互作用。


 
英拜生物microRNA報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)流程：
1.  microRNA靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)
利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)序列。
2.  獲得microRNA靶點(diǎn)序列
根據(jù)提供的靶序列，合成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA模板。或者，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全長(zhǎng)序列或靶標(biāo)序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
將合成的兩條單鏈退火成雙鏈（具有粘性末端），或?qū)CR產(chǎn)物雙酶切，后連入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的Psicheck-2載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
4.  陽(yáng)性克隆鑒定。
挑選轉(zhuǎn)化的菌落，PCR篩選含有插入片段的陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  細(xì)胞轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備
將psicheck-2報(bào)告基因載體、microRNA　mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞。
6.  熒光素酶檢測(cè)
報(bào)告基因載體與microRNA　mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞24-72h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，確定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。
提供有microRNA靶序列的報(bào)告基因質(zhì)粒、甘油保存菌株各一支。附實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括載體構(gòu)建過(guò)程，鑒定記錄，測(cè)序報(bào)告，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，熒光檢測(cè)。