LncRNA-mRNA整合分析（LncRNA芯片數(shù)據(jù)分析）

LncRNA-mRNA整合分析

1．LncRNA簡(jiǎn)要

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)水平。生物體內(nèi)含量相相當(dāng)豐富，約占RNA的4-9%（mRNA約占1-2%）。LncRNA的組織特異性及特定的細(xì)胞定位，顯示lncRNA受到高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控，目前已知其與發(fā)育、干細(xì)胞維持、癌癥及一些疾病相關(guān)。雖然近年來(lái)隨著基因芯片及第二代高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛運(yùn)用，lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，但此類轉(zhuǎn)錄本的確切功能還未知。目前市場(chǎng)上的lncRNA芯片通常將lncRNA與mRNA設(shè)計(jì)在一起，RNASeq數(shù)據(jù)中也包含lncRNA, mRNA序列，因此可以通過(guò)分析lncRNA與mRNA表達(dá)相關(guān)性對(duì)lncRNA進(jìn)行功能注釋。 

2．分析流程圖

3. 分析內(nèi)容

①計(jì)算LncRNA與mRNA表達(dá)相關(guān)性，根據(jù)設(shè)定的域值篩選lncRNA與mRNA關(guān)系對(duì)，構(gòu)建LncRNA與mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，如下是全局網(wǎng)絡(luò)

 ②基于lncRNA與mRNA表達(dá)相關(guān)性以及l(fā)ncRNA與mRNA基因組位置近鄰關(guān)系，得到lncRNA的潛在靶標(biāo)基因，對(duì)差異表達(dá)的lncRNA靶標(biāo)基因進(jìn)行功能注釋以及功能富集分析，如下是功能富集的GO的Barplot圖和差異lncRNA的Heatmap圖

③研究lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特性，基于度篩選網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渖现匾膌ncRNA，這些lncRNA極有可能是與研究背景相關(guān)的lncRNA，如下是重要lncRNA與mRNA的局部共表達(dá)子網(wǎng)絡(luò)

 ④客戶提供研究背景相關(guān)一組基因，根據(jù)表達(dá)相關(guān)性可以找出與這組基因相關(guān)的lncRNA，從而構(gòu)建出感興趣的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)能進(jìn)一步找到感興趣的 hub  lncRNA。 

lncRNA深度挖掘分析

一、差異lncRNA靶基因預(yù)測(cè)

lncRNA的靶基因較為復(fù)雜,主要分為正式和反式兩種作用機(jī)制.lncRNA作用機(jī)制與miRNA類似,均可以通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的mRNA來(lái)行使功能,所以靶基因的預(yù)測(cè)在科學(xué)研究中都顯得非常必要。

二、靶基因Gene Ontology分析
我們將靶基因向gene ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各節(jié)點(diǎn)映射,計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的基因數(shù)目.

三、靶基因Pathway分析

信號(hào)通路分析需要完備的注釋信息支持，通過(guò)整合KEGG、Biocarta、Reactome等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息可以精確檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行Pathway的顯著性分析。

四、lncRNA與調(diào)控基因的表達(dá)機(jī)制

通過(guò)整合lncRNA的信息和靶基因之間的關(guān)系,我們可以得到一個(gè)lncRNA與靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖.

五、 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

對(duì)于差異表達(dá)lncRNA，提取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下游序列,使用預(yù)測(cè)程序?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè).

六、基因關(guān)聯(lián)分析

現(xiàn)在市面上的lncRNA芯片均含有mRNA的表達(dá)探針,通過(guò)將lncRNA的靶基因分析結(jié)果與芯片上mRNA的表達(dá)結(jié)果做關(guān)聯(lián)分析,可以更進(jìn)一步的分析lncRNA的功能。

七、信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：

實(shí)驗(yàn)中基因同時(shí)參與了很多Pathway，通過(guò)構(gòu)建信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從宏觀層面看到Pathway之間的信號(hào)傳遞關(guān)系，在多個(gè)顯著性Pathway中發(fā)現(xiàn)受實(shí)驗(yàn)影響的核心Pathway，以及實(shí)驗(yàn)影響的信號(hào)通路之間的調(diào)控機(jī)理。

八、lncRNA的功能分析

根據(jù)lncRNA最新的功能數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)工具，做出Function-Tar-Net圖表，從而得出lncRNA與功能的關(guān)系

lncRNA功能實(shí)驗(yàn)

1、LncRNA定量PCR

2、LncRNA原位雜交

3、5’-RACE, 3’-RACE實(shí)驗(yàn)(lncRNA全長(zhǎng)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn))

4、lncRNA干擾實(shí)驗(yàn)

5、lncRNA過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)

需要先通過(guò)5’-RACE實(shí)驗(yàn)找到lncRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

6、lncRNA細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移