Exosome research: 外泌體介導(dǎo)的lncRUNX2-AS1從多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞到間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移對(duì)成骨的抑制作用

多發(fā)性骨髓瘤（MM）的特征是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的成骨能力降低。癌細(xì)胞和癌癥基質(zhì)細(xì)胞之間的交流是腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素。了解骨髓瘤-基質(zhì)的相互作用對(duì)于開(kāi)發(fā)可逆轉(zhuǎn)骨疾病的有效策略至關(guān)重要。近日，發(fā)表在《Oncogene》（IF=6.854）上的文章《Exosome-mediated transfer of lncRUNX2-AS1 from multiple myeloma cells to MSCs contributes to osteogenesis》報(bào)道了外泌體在MM患者骨形成抑制中的作用。他們發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤細(xì)胞中有生物活性的lncRNA RUNX2-AS1可以被包裝到外泌體中并傳遞給MSC，從而抑制MSC的成骨。RUNX2的反義鏈RUNX2-AS1在MM患者的MSCs中富集。RUNX2-AS1能夠在互補(bǔ)區(qū)域與RUNX2 前體mRNA形成RNA雙鏈體，并通過(guò)降低剪接效率而轉(zhuǎn)錄抑制RUNX2表達(dá)，導(dǎo)致MSC的成骨潛能下降，體外小鼠模型施用外泌體分泌抑制劑GW4869可有效預(yù)骨丟失。

技術(shù)路線(xiàn)

研究結(jié)果

1. MM細(xì)胞衍生的外泌體被轉(zhuǎn)移至MSC。

圖1 來(lái)自人骨髓瘤細(xì)胞系（HMCL）的外泌體的表征

a. MM1S分泌的外泌體的典型TEM成像（Bar = 100nm）。b. 動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量U266分泌的外泌體。c. HSP70衍生的外泌體中HSP70和flotillin-1蛋白的典型western blot。d. 在缺乏（對(duì)照）或存在U266衍生的PKH67標(biāo)記的外泌體的情況下培養(yǎng)BM-MSC 24小時(shí)。外泌體被BM-MSC攝取了，如共聚焦顯微鏡（原始放大倍數(shù)，×400）所示，DAPI（細(xì)胞核）和594綴合的抗肌動(dòng)蛋白抗體對(duì)MSC進(jìn)行染色。e. 用熒光標(biāo)記的外泌體孵育后的MSC的流式細(xì)胞術(shù)分析。FL1熒光表明外泌體攝取。

2. MM衍生的外泌體在MSC成骨分化中的作用。

圖2 U266衍生的外泌體對(duì)ND-MSCs1成骨分化的影響

a.b. 外泌體衍生自U266。外泌體分離后剩余的上清液。外泌體從含無(wú)外泌體的胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h的U266中分離。以U266的上清、從U266分泌的外泌體、外泌體缺失的上清或PBS培養(yǎng)一定時(shí)期的ND-MSCs1中礦化瘤的Von Kossa染色a和茜素紅染色b。轉(zhuǎn)染了從U266的外泌體中提取的總RNA，大RNA或小RNA的ND-MSCs1中礦化瘤的Von Kossa染色c和茜素紅染色d。

3. 外泌體介導(dǎo)lncRNA RUNX2-AS1從MM細(xì)胞轉(zhuǎn)移到MSC的成骨抑制作用。

圖3 參與外泌體介導(dǎo)的成骨分化減少的mRNA的鑒定

a. 特異性基線(xiàn)基因表達(dá)特征與成骨分化活性相關(guān)。典型GSEA圖解說(shuō)明：MM-MSC的轉(zhuǎn)錄物中參與成骨分化的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控基因的豐度。FDR：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，NES標(biāo)準(zhǔn)豐度得分。b. MM-MSC和NDMSCs的基因表達(dá)譜。在關(guān)于成骨分化的基因組中的MM-MSC中下調(diào)（藍(lán)色）的前50個(gè)基因。c. 特定樣品中篩選失調(diào)基因的流程圖。

圖4 外泌體lncRNA RUNX2-AS1及其對(duì)成骨分化影響的鑒定

a. 特定樣品中篩選失調(diào)基因的流程圖。b. 通過(guò)MM-MSC和ND-MSC的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行的lncRNA分析的熱圖。c. 對(duì)照、RUNX2- AS1過(guò)表達(dá)、IGKJ1過(guò)表達(dá)、PSMG3-AS1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染的ND-MSCs6、ND-MSCs7、ND-MSCs8或NDMSCs9中礦化瘤的Von Kossa 染色 and alizarin red 染色。d. 用RUNX2-AS1 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的U266中RUNX2-AS1的qPCR分析。e. 特定外泌體孵育后的MSC中RUNX2-AS1的qPCR分析。GAPDH作內(nèi)參。f. 特定外泌體孵育48小時(shí)后ND-MSCs10中礦化瘤的Von Kossa染色和茜素紅染色。g. 用熒光標(biāo)記的外泌體孵育一定時(shí)間后的MM-MSC和ND-MSC的流式細(xì)胞分析。（值是平均值±SD，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。）

4. RUNX2-AS1負(fù)調(diào)控RUNX2表達(dá)。

圖5 lncRNA RUNX2-AS1的特征，RUNX2-AS1在MSCs中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)位置

a. MSC中的RUNX2-AS1的RNA FISH測(cè)定。比例尺，20微米。b. qPCR檢測(cè)RUNX2-AS1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。GAPDH作內(nèi)參。c. 5'-RACE和3'-RACE巢式PCR產(chǎn)物的凝膠電泳。d. 使用有編碼能力的計(jì)算器（http://cpc.cbi.pku.edu.cn/）預(yù)測(cè)由RUNX2-AS1編碼的蛋白質(zhì)。FrameFinder的ORF覆蓋率：預(yù)測(cè)的ORF覆蓋率是良好ORF質(zhì)量的指標(biāo)。LOG-ODDS SCORE是預(yù)測(cè)的ORF質(zhì)量的指標(biāo)，分?jǐn)?shù)越高，質(zhì)量越好。ORF類(lèi)型是預(yù)測(cè)的ORF的完整性，其指示ORF是否以起始密碼子開(kāi)始并以框內(nèi)終止密碼子結(jié)束。e. 用于MSC中的RUNX2-AS1體外轉(zhuǎn)錄的鏈特異性RNA探針的Northern blot分析。1：MM-MSCs2，2：ND-MSCs12。β-肌動(dòng)蛋白用作對(duì)照。

5. RUNX2-AS1與RUNX2形成RNA雙鏈體并阻斷其剪接。

圖6 通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移RUNX2-AS1使MSC成骨分化降低的機(jī)制示意圖

lncRNA RUNX2-AS1可以包裝到外泌體中并從骨髓瘤細(xì)胞中分泌，轉(zhuǎn)移到MSC。在MM-MSC中，RUNX2-AS1通過(guò)干擾其剪接來(lái)降低RUNX2的表達(dá)，導(dǎo)致MM-MSC的成骨分化減少。該示意圖還顯示了RUNX2-AS1與RUNX2前體mRNA及RNA：RNA的相互作用區(qū)域。框代表外顯子。RUNX2外顯子是灰色的；RUNX2-AS1外顯子是綠色的。內(nèi)含子表示為線(xiàn)。RUNX2前體mRNA和RUNX2-AS1相互作用以紅色虛線(xiàn)表示。長(zhǎng)灰色箭頭和綠色箭頭分別表示有義RNA（RUNX2前mRNA）和反義RNA（RUNX2-AS1）的方向。PrPr：近端啟動(dòng)子，TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

6. 外泌體介導(dǎo)的體內(nèi)成骨分化減少的作用。

圖7 體內(nèi)外泌體介導(dǎo)的成骨分化減少的影響

a. 在用U266-luc +細(xì)胞靜脈注射并用GW4869或空白對(duì)照處理后原位異種移植的NPG小鼠的典型全身生物發(fā)光圖像。b. 通過(guò)無(wú)創(chuàng)生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)展。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（n = 6 /組）。c. 來(lái)自空白處理組和GW4869處理組的股骨的微電腦斷層掃描分析。在遠(yuǎn)端股骨的干涉圖的典型微CT圖像顯示空白處理的小鼠中的小梁結(jié)構(gòu)喪失，但是在GW4869處理的小鼠中沒(méi)有。圖中顯示了骨小梁的體積（d），連通性（e）和骨小梁分離（f）的骨參數(shù)。與空白處理的小鼠相比，GW4869顯著改變了血清中的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物，增加了P1NP（g）（骨形成標(biāo)志物）的水平，同時(shí)降低了CTX（h）（骨吸收標(biāo)志物）的水平。（值是平均值±SD，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，相對(duì)于載體對(duì)照）。i GW4869處理小鼠或?qū)φ招∈蟮腗SC衍生的RUNX2-AS1和RUNX2的qPCR檢測(cè)。

結(jié)論

研究結(jié)果表明外源性lncRUNX2-AS1通過(guò)獨(dú)特的外泌體lncRUNX2-AS1 / RUNX2途徑在成骨分化中從MM細(xì)胞向MSC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體lncRNA RUNX2-AS1可能成為MM骨病變的潛在治療靶點(diǎn)。