骨髓間充質(zhì)干細胞移植通過外泌體miR-125b的轉(zhuǎn)移減少梗死心臟中的自噬流
目前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間質(zhì)干細胞在心臟疾病的治療中起到重要作用，但具體相關(guān)機制還有待闡明。7月19日來自浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院胡新央、王建安教授團隊在《circulation research》(IF=15.21)發(fā)表論文，他們發(fā)現(xiàn)，MSCs（MSCs exo）分泌的外泌體可以抑制自噬流，影響P53/Bnip3信號通路從而減少細胞自噬和凋亡。RT-PCR檢測出miR-125B-5p在MSCs exo中是最豐富的，并且增加最多。它可以隨著外泌體的分泌轉(zhuǎn)移到原生細胞。在使用MSC-exo-anti-miR-125B-5p之后，MSCs對心臟的保護功能受到了抑制。這些研究結(jié)果表明，miR125B-5P通過抑制自噬，干擾P53/BNIP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而在MSCs-exo保護心功能中發(fā)揮重要作用。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
圖1 間質(zhì)干細胞移植可以抑制小鼠心肌梗死后的自噬流
A、B：心肌梗死后自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的表達；C、D：電鏡檢測自噬體；E、F：使用自噬抑制劑后，各組LC3蛋白表達；G、F：從CGA-RPG-GFP LC3轉(zhuǎn)基因小鼠中，MI后24小時在梗死邊緣區(qū)獲得心臟組織切片的代表性熒光圖像。
圖2 MSCs細胞共培養(yǎng)可以抑制自噬流減少細胞凋亡
A、B：WB檢測MSCs細胞共培養(yǎng)后LC3蛋白水平的變化；C:電鏡檢測自噬體的變化；D、E：MRFP-GFP-LC3雙染檢測自噬體與溶酶體的變化；F、G：自噬對缺氧/血清剝奪處理后細胞的影響；H、I：自噬對NMCMs與MSCs共培養(yǎng)后進行造模，細胞死亡的影響。
圖3 NMCMs中缺氧誘導(dǎo)的p53和BNIP3有助于自噬介導(dǎo)的細胞死亡
A、B：WB檢測細胞中p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK、P53、Bnip3蛋白表達變化；C、D：WB檢測組織中P53、Bnip3蛋白表達變化；E-H:p53、Bnip3腺病毒轉(zhuǎn)染檢測自噬蛋白LC3的變化；I-L：熒光染色檢測評價p53、Bnip3腺病毒轉(zhuǎn)染后細胞的死亡；M-P：熒光染色檢測Atg7siRNA干擾且經(jīng)過p53、Bnip3腺病毒轉(zhuǎn)染后細胞的死亡。
圖4 p53介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)的細胞死亡是BNIP3依賴的
A-D：WB檢測p53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后P53、Bnip3 蛋白表達情況；E、G：WB檢測p53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后LC3蛋白表達情況;I、J:WB檢測P53轉(zhuǎn)染NMCMs后，LC3蛋白表達；K-N：熒光染色檢測P53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后細胞死亡狀況；O-P：熒光染色檢測Bnip3 siRNA干擾且轉(zhuǎn)染腺病毒p53后細胞死亡狀況。
圖5 骨髓間充質(zhì)干細胞可調(diào)節(jié)NMCMs的自噬流，增強細胞活力
A、B: WB檢測MSCs來源的外泌體處理NMCMs細胞，LC3蛋白表達的變化;C、D: mRFP-GFP-LC3熒光染色檢測MSCs-exo孵育NMCMs細胞后對自噬體和自噬溶酶體的影響；E、F: 熒光染色檢測MSCs-exo對細胞死亡的影響；G、H：WB檢測MSCs-exo孵育NMCMs細胞后p53和Bnip3 蛋白表達的影響。
圖6 MSC-125B-5P在骨髓間充質(zhì)干細胞中的丟失導(dǎo)致其在體外的自噬調(diào)節(jié)和心臟保護功能喪失
A：RT-PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞中的外泌體中miRNA的含量；B：細胞中mir-125B-5P水平最高；C、D：WB檢測加或不加anti-miR-125b后LC3蛋白的表達；E、F：mRFP-GFP-LC3熒光檢測加或不加anti-miR-125b后自噬體與自噬溶酶體的變化；I、J：WB檢測加或不加anti-miR-125b后p53、Bnip3蛋白的表達。
圖7 MSC-125B-5P在骨髓間充質(zhì)干細胞中的丟失導(dǎo)致其在體內(nèi)的自噬調(diào)節(jié)和心臟保護功能喪失
圖8 MSC-125B-5P在骨髓間充質(zhì)干細胞中的丟失導(dǎo)致MI后心臟功能恢復(fù)受到障礙
A、B： exo處理可以減少心肌梗死面積；C-G：超聲心電圖顯示exo處理可以改善小鼠MI后的心功能。