在三陰性乳腺癌中LINC01638 lncRNA通過抑制SPOP調(diào)節(jié)的c-Myc降解而激活MTDH-Twist1信號通路

乳腺癌是多樣化疾病，并且三陰性乳腺癌（TNBC）仍然是一個很嚴(yán)重的健康問題。已有研究報道，LINC01638（基因間長非編碼蛋白RNA 1638）在人類正常組織中低表達(dá)，并且還參與了肝癌細(xì)胞的EMT過程。關(guān)于lncRNAs在TNBC進(jìn)展中潛在作用仍然沒有探究。鑒于以往研究成果，Guopei Zheng和Xiaoming Xie帶領(lǐng)的團(tuán)隊進(jìn)一步探究了LINC01638在TNBC中的功能，并于2018年6月8日在Oncogene雜志（IF=7.5）上發(fā)表了這篇文章。這篇文章證明了LINC01638在TNBC組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)，并且能夠維持TNBC細(xì)胞中的間質(zhì)特性，包括含有豐富的上皮間質(zhì)間轉(zhuǎn)換（EMT）信號和癌癥干細(xì)胞狀態(tài)。下調(diào)LINC01638能夠在體外和體內(nèi)抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。過表達(dá)LINC01638預(yù)示著對乳腺癌病人有不良的預(yù)后效果。LINC01638能與c-Myc相互作用，能夠抑制SPOP調(diào)節(jié)的c-Mcy的泛素化和降解。C-Mcy能夠提高M(jìn)TDH的表達(dá)，進(jìn)一步激活Twist1的表達(dá)，最終誘導(dǎo)EMT。該文章的結(jié)果證明，LINC01638能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，并且突出了LINC01638在TBNC發(fā)張過程中所扮演的重要角色。

技術(shù)路線

結(jié)果

圖1. 在TNBC亞型中，LINC01638 lncRNA上調(diào)

A. qRT-PCR檢測 LINC01638在不同乳腺癌亞型組織中的表達(dá)情況。B. qRT-PCR檢測LINC01638在BC細(xì)胞系中的表達(dá)情況。CD. 在線分析LINC01638轉(zhuǎn)錄本中蛋白編碼和核糖體結(jié)合位點。EF. 全長LINC01638或ORF克隆到真核表達(dá)載體（pCMV-Flag）中，在這兩種不同的表達(dá)模式下，加或不加N-末端密碼子ATG，MDA-MB -231細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后進(jìn)行WB檢測，p21作為陽參。Flag-抗體用于轉(zhuǎn)錄后蛋白的標(biāo)記，黑色箭頭指p21-Flag蛋白。G. 利用qRT-PCR對MDA-MB -231細(xì)胞進(jìn)行分餾，BCAR4作為核基因的陽參，GAPDH作為胞質(zhì)基因的陽參。

圖2.LINC01638能夠促進(jìn)BC細(xì)胞的間質(zhì)性特點

A. 通過轉(zhuǎn)染LINC01638 shRNA，建立LINC01638下調(diào)的穩(wěn)定MDA-MB-231和BT549細(xì)胞系。B. 下調(diào)LINC01638抑制MDA-MB-231和BT549細(xì)胞的增殖。C. 通過轉(zhuǎn)染EXP-LV203-LINC01638載體建立穩(wěn)定表達(dá)LINC01638的T47D細(xì)胞系（左），過表達(dá)LINC01638促進(jìn)T47D細(xì)胞的增殖。D. 克隆的細(xì)胞進(jìn)行transwell。E. LINC01638下調(diào)或過表達(dá)后進(jìn)行克隆后，F(xiàn)ACS檢測CD44+CD24-(CSC)亞群的表達(dá)。F. LINC01638下調(diào)或過表達(dá)進(jìn)行克隆后，進(jìn)行微球體形成實驗。G. qRT-PCR檢測檢測細(xì)胞克隆條件下EMT的表達(dá)水平。H. WB檢測EMT的marker。

圖3.LINC01638能夠通過MTDH調(diào)節(jié)間質(zhì)特點

A. qRT-PCR檢測在不同的乳腺癌亞型組織中MTDH的表達(dá)情況（左），在組織中LINC01638和MTDH的表達(dá)相關(guān)性（右）。B. qRT-PCR和WB檢測MTDH在細(xì)胞系的的表達(dá)情況。C. 下調(diào)LINC01638后，MTDH表達(dá)下調(diào)（上）；過表達(dá)LINC01638后，MTDH上調(diào)（下）。D. 在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)MTDH能夠抵消下調(diào)LINC01638后導(dǎo)致的增殖、侵襲和產(chǎn)生CD44+/CD24? (CSC)亞群的效應(yīng)。E. 在T47D細(xì)胞中，下調(diào)MTDH的表達(dá)能夠抵消過表達(dá)LINC01638后導(dǎo)致的增殖、侵襲和產(chǎn)生CD44+/CD24? (CSC)亞群的效應(yīng)。F. 在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)MTDH能夠抵消下調(diào)LINC01638后導(dǎo)致的EMT的效應(yīng)。G. 在T47D細(xì)胞中，下調(diào)MTDH的表達(dá)能夠抵消過表達(dá)LINC01638后導(dǎo)致的EMT的效應(yīng)。

圖4. MTDH在BC細(xì)胞中能夠被c-Mcy調(diào)節(jié)

A. 預(yù)測c-Myc在MTDH啟動子中的結(jié)合位點。BC. qRT-PCR（B）和WB（C）分別檢測再細(xì)胞系中c-Myc下調(diào)或過表達(dá)后MTDH的表達(dá)情況。D. 通過ChIP-qPCR檢測，c-Myc主要結(jié)合在MTDH啟動子的B位點。E. ChIP-qPCR檢測顯示，影響c-Myc的表達(dá)水平后能夠影響c-Myc與MTDH啟動子的結(jié)合水平。F. 在BC細(xì)胞系中，通過熒光酶報告系統(tǒng)檢測MTDH啟動子活性與c-Myc的相關(guān)性。

圖5.LINC01638與c-Mcy相互作用抑制SPOP調(diào)節(jié)的降解

A.通過在線軟件分析TCGA數(shù)據(jù)，比較c-Myc在乳腺癌和正常乳腺中的表達(dá)情況。B. WB檢測，下調(diào)LINC01638后MG-132對c-Myc表達(dá)水平的調(diào)節(jié)效果。C. WB檢測，下調(diào)LINC01638后下調(diào)SPOP對c-Myc表達(dá)水平的調(diào)節(jié)效果。D. RIP驗證LINC01638和c-Myc、SPOP的相互作用。E. CoIP驗證c-Myc和SPOP的相互作用。F. Mapping分析c-Myc與LINC01638相互作用域。全長LINC01638 和縮短LINC01638片段的原理圖（左）；在293T細(xì)胞中，RIP驗證縮短LINC01638片段與c-Myc的相互作用（右）。G. 識別c-Myc蛋白與LINC01638相互結(jié)合的區(qū)域。c-Myc蛋白的片段（左），在293T細(xì)胞中，RIP驗證LINC01638與c-Myc的相互作用區(qū)域（右）。H. LINC01638對c-Myc核定為的影響。 I. 在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)c-Myc能夠抵消下調(diào)LINC01638后對增殖和侵襲的效應(yīng)。在T47D細(xì)胞中，下調(diào)c-Myc能夠抵消過表達(dá)LINC01638后對增殖和侵襲的效應(yīng)。

圖6.LINC01638能夠在體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌的腫瘤進(jìn)展

A. 下調(diào)LINC01638能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞來源的腫瘤的生長，上調(diào)c-Myc的表達(dá)會抵消LINC01638的下調(diào)效應(yīng)。B. 通過尾靜脈注射下調(diào)LINC01638的MDA-MB-231細(xì)胞，下調(diào)或過表達(dá)c-Myc后，HE染色小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)點。C.在乳腺癌組織中，ISH染色LINC01638蛋白，IHC染色c-Myc、MTDH、Twist1蛋白。D. Kaplan–Meier分析高表達(dá)LINC01638后與乳腺癌病人預(yù)后的相關(guān)性。