核仁小 RNA（snoRNAs）研究
核仁小 RNA(snoRNAs)是一類廣泛存在于真核生物細胞核仁的小分子非編碼 RNA，長度60-300nt，能與核仁核糖核蛋白結合形成 snoRNPs 復合物[1]。在脊椎動物中編碼核仁小 RNA 的基因主要存在于蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因的內含子區(qū)域，并且經(jīng)過進一步的轉錄后加工處理形成成熟的核仁小 RNA[2]。具有保守的結構元件，按結構可以分為三類：box C/D snoRNA、 box H/ACA snoRNA 和 MRP RNA（研究較少）。在核糖體 RNA 的加工過程中，前兩類 snoRNAs 分別發(fā)揮兩種修飾作用：核糖體 RNA 的 2 -O– 甲基化和假尿嘧啶化[3]。絕大多數(shù) snoRNA 的宿主基因編碼的蛋白或者轉錄本為核糖體的生物合成與功能所必須，且作為 5′末端寡嘧啶家族參與生長依賴的翻譯調控。 snoRNAs 參與的生物學過程主要有 rRNA 的加工處理，RNA 剪接和翻譯過程的調控以及氧化應激反應[4]。由于 snoRNA 被認為主要存在于核仁中，功能單一，之后的很長一段時間，snoRNA 的研究陷入低潮。然而，近幾年，隨著測序技術的發(fā)展，越來越多的數(shù)據(jù)表明 snoRNA 在腫瘤中被異常調控，還參與到遺傳性疾病、造血、代謝以及癌癥的過程中。
1. snoRNAs 的生物合成
snoRNAs 主要包含兩個家族：C/D box snoRNAs 與 H/ACA box snoRNAs [5] (圖 1)。大多數(shù) snoRNAs 主要位于由 RNA 聚合酶 II 轉錄的基因的內含子區(qū)域。但 snoRNAs 也可以來源于長鏈非編碼 RNA（lncRNA）的內含子區(qū)域。從內含子上脫離后，pre-snoRNAs進一步的被核酸外切酶處理去除兩端的多余序列，進而形成成熟的 snoRNAs。snoRNAs內部的信號序列指導 snoRNAs 與相應蛋白結合形成 snoRNP 復合物來避免被酶切，進而發(fā)揮功能。snoRNP 復合物能夠分為兩類 C/D box snoRNP 和 H/ACA box snoRNP。C/D box snoRNP 包含四種進化上保守的，必需的蛋白質，即纖維蛋白(fibrillarin)/Nop1p、Nop56、Nop58/Nop5p 和 p15.5KD/ Snu13p，而 H/ACA box snoRNP 的結合蛋白包括進化保守的 Cbf5p(dyskerin)、Gar1p、Nhp2p 和 Nop10p。
圖1 box C/D snoRNA、 box H/ACA snoRNA結構以及生物合成（圖片來源:Thorenoor, N. and O. Slaby (2015)）
圖2 snoRNAs的生物學功能(圖片來源:Makarova, J. A., S. M. Ivanova, et al. (2013))
2. snoRNAs的生物學功能[6]（圖2）
1）snoRNAs 與核糖體 RNA 加工
在核糖體 RNA 的加工過程中，核糖體 RNA 的 2′-O–甲基化由 C/D box snoRNAs 來負責。 C/D box snoRNAs 包含有兩個短的序列元件，即位于 5 " 末端的 box C(RUGAUGA R 代表 A 或 G)和 3" 末端的 box D(CUGA)。多數(shù) box C/ D snoRNAs 基因的 5" 和 3" 末端都有 4 -5 nt 的反向重復序列，可以形成較為穩(wěn)定的短莖結構，這一結構在 snoRNAs 的生物合成和核仁定位過程中起關鍵作用[7]。核糖體 RNA 的假尿嘧啶修飾主要是由 H/ACA box snoRNAs 來完成的。H/ACA box snoRNAs 具有保守的“發(fā)夾-鉸鏈-發(fā)夾-尾”的二級結構。box H (ANANNA，N 代表任一核苷酸)位于單鏈形式的鉸鏈區(qū)，ACA則一般位于 3" 末端上游 3 個核苷酸處。H/ACA box snoRNAs 的指導序列位于單個或者兩個發(fā)夾內部的“假尿嘧啶化泡”內，它們可以與靶 RNA 上的被修飾位點兩翼序列各形成 4-8nt 的互補配對。
2）snoRNA 與 mRNA 3’末端加工
在一項新的研究中，研究人員通過生化分析和大規(guī)模測序，發(fā)現(xiàn) mRNA 3'末端加工復合體和部分 snoRNA 相互作用。在對其中的一種 snoRNA 富含 U/A 的 SNORD50A 進一步開展體外實驗和體外實驗，結果表明 SNORD50A 在 mRNA 3'末端加工中主要發(fā)揮著一種競爭性抑制的用，并最終影響 mRNA 水平的表達[8]（圖 3）。
3）snoRNAs 與應激反應
snoRNAs 有助于細胞應對應急反應。棕櫚酸酯處理能夠導致細胞中 SNORDs 32A, 33以及 35A 的表達水平也顯著提高。細胞對棕櫚酸酯產(chǎn)生抗性是由于抑制了 SNORDs 32A,33和35A 的表達，它們介導了由誘導劑引起的細胞死亡[9]。在缺氧條件下，SNORD14A和 SNORD83B 的表達水平得到顯著提高[10]
4）snoRNAs 派生的小 RNAs
miRNA 在一系列調控過程中起著重要作用，如細胞存活和細胞增殖的調控, 由 snoRNAs 產(chǎn)生的 sno-miRNAs 產(chǎn)生的小 RNA 具有雙重功能,同樣的轉錄本可以作為 snoRNA 和 miRNA 的前體。ACA45 是第一個被報道能夠被降解成短片段 snoRNAs，它是通過與 Ago 蛋白的相互作用被發(fā)現(xiàn)的，而 Ago 作為 miRNA RISC 復合物的成員，這就表明 ACA45 的進一步的加工處理是依賴于 Dicer 酶的。降解產(chǎn)生的 20-22nt 的短片段 RNA 的作用機制類似與 miRNA 抑制目的基因(CDC2L6)的表達[11]。很多研究揭示了 snoRNAs 可能參與抑癌基因 P53 的調控，snoRNA 來源的 miR-605 被報道能抑制 MDM2 蛋白合成，從而促進抑癌基因 P53 的表達（圖 4）近期報道發(fā)現(xiàn) 11 個 C/D box snoRNAs 能夠降解形成短片段 RNA 從而抑制靶基因的表達[12]。在最新的研究中 snoRNAs 進一步被加工成更小的 RNAs 被稱為 sno 派生的 RNAs (sdRNAs)，通過對來自 32 種癌癥類型的 10262 例患者樣本的~22 nt 大小的 smRNA-seq 數(shù)據(jù)集的綜合分析，研究人員繪制了泛癌 sdRNAome 的圖譜，結合多個臨床相關特征上的特征，特別是癌癥免疫和臨床結果。大量的 sdRNAs 與腫瘤免疫微環(huán)境特征顯著相關，如免疫抑制標志物、CD8+ T 細胞浸潤、細胞溶解性 T 細胞活性、腫瘤血管組織等[13]。
圖3 snoRNA與mRNA 3’末端加工（圖片來源：Huang, C., J. Shi, et al. (2017)）
圖4 microRNA和snorna介導的p53正反饋環(huán)（圖片來源：Liao J, et al.. 2010.）
5）特殊的 Sno-lncRNA
在 2012 年由上海生化所陳玲玲課題組率先鑒定出來, Sno-lncRNA 是一類新型的長非編碼 RNA，它們的序列中包含完整的 snoRNA 序列，并且該序列對 sno-lncRNA 的穩(wěn)定性和亞細胞定位至關重要,研究表明 sno-lncRNA 長非編碼 RNA SLERT 通過松弛 DDX21 的環(huán)形結構，從而促進 Pol I 轉錄 rRNA 的重要作用[14]。
6）snoRNAs 與腫瘤發(fā)生發(fā)展
snoRNAs 參與的癌癥的分子病理學，在早年的研究中在非小細胞肺癌中多種 snoRNAs 呈現(xiàn)出不同的表達狀態(tài)[15]。snoRNAsU50 2bp 純合缺失突變與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關[16]并且在乳腺癌中 U50 具有雜合缺失以及轉錄下調的特點[11]。通過基因組芯片技術檢測到 SNORD33, SNORD66, SNORD73B, SNORD76,SNORD78, and SNORA42 六種 snoRNAs 在非小細胞肺癌(NSCLC)是表達上調的他們通常位于肺癌的頻繁擴增的基因組區(qū)域[17]。snoRNAs 與腫瘤的關系也能夠延伸到與它們相互作用的蛋白分子上。 Fibrillarin 是發(fā)育必須的，缺失 Fibrillarin 能夠導致胚胎致死。在乳腺癌的研究中當高水平的 Fibrillarin 干擾應激激活 p53，snoRNA 通路被抑制時，腫瘤抑制因子 p53 可以作為 snoRNP 擾動的前哨，激活其介導生長抑制作用[18]。Dyskerin、NOP10以及 Nhp2p 的突變與上皮癌有關[19]。snoRNAs 以及 snoRNP 很可能是通過影響核糖體和蛋白的翻譯來影響腫瘤的發(fā)生的，因為在癌細胞中翻譯過程總是異常的。但是 snoRNAs 也可能通過降解的短片段 RNA 來發(fā)揮 miRNA 功能進而調節(jié)基因的表達來影響腫瘤的發(fā)生。最新的研究發(fā)現(xiàn)，一種管家型 snoRNA 分子是著名癌分子 K-RAS 的開關，研究人員調查了 12 種常見人類癌癥，包括皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和肺癌中，10-40%的腫瘤缺失一對稱作為 SNORD50A/B 的 snoRNAs。在人類黑色素瘤和肺癌細胞中， SNORD50A/B 結合 KRAS 時，它會抑制 KRAS 蛋白結合一種稱作為法尼基轉移酶的活化分子的能力。法尼基轉移酶改變 KRAS 蛋白使得它能夠去到細胞膜等待外部生長及分裂信號[20]。2017 年研究者通過 RNA-seq 對比 Aes（癌基因）缺失前后轉錄組的變化，意外發(fā)現(xiàn)大量的 snoRNA 下調，而在過表達 Aes 后 snoRNA 表達量顯著上升，這說明 Aes 能影響 snoRNA 的表達，敲除單個 snoRNA，rRNA 的甲基化顯著降低，并且抑制白血病細胞的克隆形成能力[21]。
6）snoRNAs 作為癌癥診斷和預后生物標志物
snoRNAs 在細胞中的功能是多樣的，腫瘤特異表達的 snoRNAs 可能作為癌癥相關的生物標志物。研究報道 snoRNAs 能夠在外周血漿以及血清中穩(wěn)定存在且可測，這使 snoRNAs 作為潛在的循環(huán)腫瘤生物標志物成為可能 [22] 。在非小細胞肺癌中 SNORD33,SNORD66 和 SNORD76 不僅在腫瘤中高表達并且在血漿中也檢測到高表達，這使辨別非小細胞肺癌患者成為可能[23]。SNORA42 雖在組織相關疾病的預后檢測效果較差，但可以預測疾病[24]。SNORD43, SNORD44 和 SNORD48 作為乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌潛在的抑制劑[25]。SNORD113-1 在原發(fā)性肝細胞癌中表達下調并且在原發(fā)性肝細胞癌中作為抑癌基因發(fā)揮功能[26]。總之，snoRNAs 可以作為癌癥診斷和預后的潛在的生物標志物。snoRNAs 作為癌癥治療的潛在靶點，例如，snoRA42 在肺癌中是高表達的，在肺癌細胞中選擇性的沉默 snoRNAs42，細胞的增殖能力和活力明顯下降。
7）snoRNAs與疾病
SNORD116的缺失是導致Prader Willi綜合癥發(fā)病的主要原因。SNORD115表達水平的變化導致了各種心理和行為畸變典型自閉癥[27]。同時另外一項研究報道在病毒感染的細胞中一系列snoRNAs一方面snoRNAs可以作為受體抗病毒反應的調節(jié)者；另一方面，調控RNA的活性可以被病毒利用使其逃避天然免疫從而完成其生命周期[28]。在之前的研究中，C/D box snoRNAs 表達水平的變化也發(fā)生在孕婦酒精消耗引起的異常胎兒大腦發(fā)育的過程中，在此過程中SNORD115表達上調，SNORD116表達下調[29]。最新的研究者繪制了哺乳動物大腦snRNA和snoRNA表達圖譜，發(fā)現(xiàn)哺乳動物大腦snRNA和snoRNA表達水平存在廣泛差異。其中U1和SNORA29表達量在人腦中卻發(fā)生了巨大變化[30]。
研究案例
1）“Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53” Gastroenterology 2018（IF=20.773）[26]
該研究是基于生殖系拷貝數(shù)變異(CNV)的全基因組關聯(lián)分析（GWAS），通過對比1583例乙型肝炎病毒（HBV）相關的肝癌患者與1540例乙型肝炎病毒（HBV）相關的非肝癌患者，發(fā)現(xiàn)了一個低頻重復染色體15q13.3與乙型肝炎病毒相關的肝癌患病風險密切相關（P=3.17×10–8;odds ratio, 12.02)。15q13.3的拷貝數(shù)與SNORA18L5在肝組織中的表達相關。過表達SNORA18L5的增加了小鼠肝癌細胞的增殖和移植瘤的生長;干擾SNORA18L5降低了肝癌的增殖和腫瘤的生長。SNORA18L5在HepG2和SMMC-7721細胞中的過表達可抑制p53依賴性細胞周期阻滯和凋亡。SNORA18L5的過表達導致核糖體生物合成活性增強，成熟的18S和28S rRNA水平升高，導致核糖體蛋白RPL5和RPL11停留在核仁中，從而阻止它們與MDM2結合。這導致了MDM2介導的p53泛素化和降解的增加。與非腫瘤肝組織相比，HCC組織中SNORA18L5水平升高，且患者生存時間縮短。該研究深入淺出的從中國人口全基因組的生殖拷貝數(shù)的突變入手進一步揭示了CNV的突變通過snoRNA的差異表達來影響乙型肝炎病毒（HBV）相關的肝癌。
圖5 15q13.3的拷貝數(shù)突變位點與SNORA18L5相吻合
圖6細胞與動物實驗證明SNORA18L5與腫瘤細胞增殖的關系
圖7 SNORA18L5與MDM2以及抑癌基因P53
2）“AML1-ETO requires enhanced C/D box snoRNA/RNP formation to induce self-renewal and leukaemia”Nature Cell Biology 2017(IF:20.060) [21]
白血病發(fā)生需要增強由致癌基因引起的自我更新。其潛在的分子機制尚不完全清楚。本文確定C/D box snoRNAs和rRNA甲基化是白血病干細胞活性的關鍵決定因素。Aes基因在有融合基因AML1-ETO, PML-RARα和PLZF-RARα的白血病中高表達，但是其功能和機制一直是未知的。研究者通過老鼠模型和細胞系實驗，發(fā)現(xiàn)Aes對腫瘤細胞的自我更新能力是至關重要的。研究者通過RNA-seq對比Aes（癌基因）缺失前后轉錄組的變化，意外發(fā)現(xiàn)大量的snoRNA下調，而在過表達Aes后snoRNA表達量顯著上升，這說明Aes能影響snoRNA的表達。有趣的是，研究者利用CRISPR技術敲除snoRNA后，發(fā)現(xiàn)即使是敲除單個snoRNA，rRNA的甲基化顯著降低，并且抑制白血病細胞的克隆形成能力。這說明，snoRNA不僅是一類受癌細胞調控的非編碼RNA，更參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。AES通過與RNA解旋酶DDX21相互作用誘導snoRNA/RNP形成。
圖8 Aes的缺失導致snoRNA的下調
3）“The noncoding RNAs SNORD50A and SNORD50B bind K-Ras and are recurrently deleted in human cancer” Nature genetics 2016 (IF=27.125) [20]
研究人員發(fā)現(xiàn)一對原以為只是充當細胞管家的RNA分子，在超過四分之一的常見人類癌癥中缺失。研究人員比較了21種不同癌癥類型中的5,473個腫瘤基因組及周圍正常組織的基因組。研究人員發(fā)現(xiàn)在12種常見人類癌癥，包括皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和肺癌中，10-40%的腫瘤缺失一對稱作為SNORD50A/B的snoRNAs。在人類黑色素瘤和肺癌細胞中刪除SNORD50A/B時，細胞更快速地分裂，顯示出更多的癌性狀。
通過人類蛋白微陣列檢測到SNORD50A/B能直接結合到KRAS蛋白，當SNORD50A/B結合KRAS時，它會抑制KRAS蛋白結合一種稱作為法尼基轉移酶（farnesyltransferase）的活化分子的能力。法尼基轉移酶改變KRAS蛋白使得它能夠去到細胞膜等待外部生長及分裂信號。SNORD50A與SNORD50B缺失能增加GTP結合的數(shù)目，激活K-Ras，以及增加法尼基轉移酶結合到K-Ras并且促進K-Ras異戊二烯化，這些均揭示了K-Ras的突變與SNORD50A與SNORD50B缺失起協(xié)同作用。
圖9 多數(shù)據(jù)庫分析SNORD50A/B在腫瘤中的缺失以及SNORD50A/B與KRAS蛋白的直接結合
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