EXO1核酸酶活性在Exo1D173A小鼠基因組維持、免疫應答和腫瘤抑制中的作用

外切酶1 (EXO1)是一種多效進化保守的DNA外切酶，參與多種DNA修復途徑、復制、抗體多樣化和減數(shù)分裂。目前有研究發(fā)現(xiàn)EXO1在不同的DNA修復過程中同時具有支架和酶的功能，并表明EXO1在DNA代謝過程和疾病中具有更加復雜的作用。該研究發(fā)表于2022年7月發(fā)表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》，IF：19.160

技術路線：

主要研究結(jié)果：

1. 構建核酸酶死亡的Exo1^D173A小鼠

為了創(chuàng)建失活核酸酶死亡的EXO1突變，作者通過CRISPR/Cas9技術在C57BL/6雌性小鼠分離的受精卵中產(chǎn)生了一個新的攜帶EXO1^D173A突變的敲入小鼠 (稱為Exo1^DA)。EXO1^D173殘基在裂變和出芽酵母以及小鼠和人類中都是進化保守的(圖1A, B)。此外，對分解后的EXO1晶體結(jié)構的結(jié)構建模顯示，殘留物EXO1^D173嵌入外切酶活性位點，并與DNA片段直接接觸，這預測了EXO1核酸酶活性位點的顯著異常是由于EXO1^D173A突變的結(jié)果(圖1C)。然而，這種擾動并不會影響蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性、DNA結(jié)合或MMR蛋白相互作用，這是由不同的結(jié)構域依賴性所證明的(圖1B, C)。

圖1 在小鼠中建EXO1突變模型

2. 在典型DDR中，EXO1的催化活性高于支架功能

為了測定MMR在體內(nèi)功能的完整性，將Exo1^+/+、Exo1^DA/DA和Exo1 ^{- /-}小鼠與BigBlue小鼠雜交，分析所有三個隊列中肝臟和脾臟基因組DNA中cII報告基因的突變積累。結(jié)果顯示，Exo1^?/?和Exo1^DA/DA突變小鼠的突變率均比Exo1^+/+小鼠高2-3倍，從而證實了Exo1的催化作用對于哺乳動物細胞體內(nèi)經(jīng)典的無錯誤DNA錯配修復至關重要(圖2A)。為了研究EXO1在DSBR中的作用，從Exo1^+/+、Exo1^DA/DA和Exo1 ^{- /-}小鼠中建立了原代小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)，并量化了中期擴散中的染色體斷裂(圖2B)。然后，研究了過度磷酸化RPA (S4/S8-pRPA)和γH2AX的頻率和灶內(nèi)共定位，它們是PI3家族的DNA損傷激活蛋白激酶在DSBs上的反應，如ATM/ATR(圖2C)，其中Exo1^?/?和Exo1^DA/DA MEFs均顯示激活的pRPA-S4/S8和γH2AX的共定位顯著降低(圖2C)。這些結(jié)果表明，CPT治療導致DSB切除受損，并提示EXO1在有絲分裂細胞中DSBR過程中的催化活性起著關鍵作用。另外，與Exo1^+/+ MEFs相比，Exo1^?/?和Exo1^DA/DA p53缺陷MEFs對MNNG處理的抗性增加，盡管在Exo1^DA/DA突變體中表現(xiàn)得稍弱，但這表明在兩種Exo1突變背景下，DDR信號傳導效率低下(圖2D)。這些結(jié)果表明，EXO1的核酸酶活性有助于MMR介導的DDR信號轉(zhuǎn)導。

圖2典型DDR需要EXO1體內(nèi)的核酸酶活性

3. EXO1的催化功能對生存和腫瘤抑制具有重要作用

Exo1^+/+小鼠在24月齡時有50%的小鼠存活，但Exo1^?/?和Exo1^DA/DA小鼠在16月齡時有50%的小鼠死亡，其存活率也有類似的下降(圖3A)。Exo1^?/?和Exo1^DA/DA小鼠的加速死亡率原因是由于發(fā)病率相當?shù)陌┌Y易感性增加(圖3B)。大多數(shù)Exo1^DA/DA小鼠在6 - 22月齡期間死于淋巴瘤(58%，n = 14/24)(圖3C, D)。Exo1^?/?的腫瘤譜與Exo1^DA/DA小鼠的腫瘤譜基本相同(圖3C, D)。綜上所述，這些結(jié)果表明完整的核酸酶活性對EXO1腫瘤抑制功能至關重要。

圖3 EXO1核酸酶死亡突變體在腫瘤發(fā)生中的作用

4. 在抗體分化過程中，非規(guī)范DDR需要EXO1的催化和結(jié)構功能

為了描述EXO1結(jié)構和/或催化功能在SHM過程中的精確貢獻，檢查到EXO1^+/+ (n = 7)、Exo1^DA/DA (n = 8)和EXO1^?/?(n = 3)隊列中VH186.2重鏈可變區(qū)在初級免疫反應中的錯誤修復(圖4A和B)。在Exo1^?/?和Exo1^DA/DA小鼠中，A:T和Pol熱點位點的突變顯著減少，但在G:C和AID熱點位點的其余突變不僅受到限制，而且增加(圖4A)。與完全缺失相比，突變的EXO1^DA蛋白存在時，A:T位點易出錯修復的后一種缺陷沒有那么顯著(圖4A)，這表明EXO1^{DA /DA} B細胞中可能仍然存在一些中間支架功能。在兩種Exo1受損模型中，雖然可以觀察到A:T突變在VH186.2區(qū)域的傳播減少，特別是在Pol熱點區(qū)域，但Exo1^?/?小鼠表現(xiàn)出更明顯的表型改變，其僅剩的少量A:T突變分布在CDR2周圍(圖4B)。另一方面，在Exo1^?/?和Exo1^+/+小鼠中，CDR中G:C位點突變的總體分布和偏好保持不變，甚至在非熱點G:C位點上有所增加(圖4B)?？傊?，免疫球蛋白基因的體內(nèi)SHM分析表明，Exo1的結(jié)構和酶功能共同作用，在AID誘導的U:G錯配周圍提供足夠的易出錯的MMR。

LPS和IL-4在體外誘導IgM到IgG1亞型轉(zhuǎn)換(圖4C)。與Exo1^+/+組相比，兩個Exo1突變組對IgG3和IgG1的CSR效果均顯著降低(圖4C和D)，這表明Exo1核酸酶活性對CSR至關重要。Exo1DA/DA細胞中的Su-Sγ3連接與Exo1^+/+或Exo1^?/?細胞中的Su-Sγ3連接不同(圖4E)。綜上所述，這些結(jié)果似乎表明，雖然EXO1核酸酶活性有助于在CSR過程中促進微同源性介導的aNHEJ的末端切除機制，但在完全缺乏EXO1的情況下，一種催化死亡蛋白可能會干擾其他可能參與aNHEJ過程并部分補償?shù)囊蛩亍?/span>

圖4 破壞EXO1或其核酸酶活性會損害抗體的多樣性

5. 對于減數(shù)分裂來說，重要的是EXO1的結(jié)構功能，而不是催化活性

在我們所有的基因型隊列中，MLH1和CDK2定位于交叉位點，CDK2另外定位于端粒(圖5)。這些交叉標記仍然與SYCP3、染色體核心和/或端粒相關，其頻率和強度在Exo1^+/+、Exo1^DA/+和Exo1^DA/DA小鼠中是不可區(qū)分的(圖5)，表明正常的減數(shù)分裂進展通過前期I期。此外，通過分析和量化中期擴散，結(jié)果表明交叉染色體和二價染色體的數(shù)量在所有組中也具有可比性(圖5)。綜上所述，這些結(jié)果表明，在減數(shù)分裂過程中，EXO1核酸酶活性是可有可無的，而非其結(jié)構功能。

圖5在精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂中，EXO1核酸酶活性是可有可無的

結(jié)論：

該研究表明EXO1根據(jù)其參與的過程和DNA修復過程的復雜性，在基因組維護中實現(xiàn)3層活性。一層主要依賴于EXO1的核酸酶功能，如典型的MMR和DSBR。另一層主要依賴于支架功能，如減數(shù)分裂，最后一層依賴于核酸酶和支架功能在B細胞非典型修復過程中的協(xié)同作用，以實現(xiàn)抗體多樣化。

參考文獻：

Wang S, Lee K, Gray S, Zhang Y, Tang C, Morrish RB, Tosti E, van Oers J, Amin MR, Cohen PE, MacCarthy T, Roa S, Scharff MD, Edelmann W, Chahwan R. Role of EXO1 nuclease activity in genome maintenance, the immune response and tumor suppression in Exo1D173A mice. Nucleic Acids Res. 2022:gkac616.