巨噬細(xì)胞分泌外泌體促進(jìn)胰腺癌抵抗吉西他濱

吉西他濱通過終止DNA復(fù)制來抑制細(xì)胞生長的一種抗腫瘤藥物，臨床上用作晚期胰腺癌患者在氟尿嘧啶類失敗后的二線用藥，能夠改善患者的生活質(zhì)量，但胰腺導(dǎo)管腺癌會(huì)對(duì)吉西他濱產(chǎn)生抵抗。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞最近被證明能夠促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的抵抗，但是這一過程的確切機(jī)制還不明確。

最近來自以色列Rambam醫(yī)學(xué)中心的研究人員對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌抵抗抗腫瘤藥物吉西他濱的機(jī)制進(jìn)行了深入研究，并將相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Cancer Research上（IF=9.130）。在這項(xiàng)研究中，研究人員通過一個(gè)胰腺導(dǎo)管腺癌的基因小鼠模型和電鏡分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過分泌外泌體與腫瘤微環(huán)境交流，并且這些外泌體能夠被癌細(xì)胞特異性捕獲內(nèi)化。研究人員將合成的dsDNA轉(zhuǎn)入小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中，再將細(xì)胞注射到胰腺導(dǎo)管腺癌荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)原位腫瘤和肝轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的dsDNA片段濃度比正常組織中更高。

研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體能夠顯著降低胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，無論是在體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均如此。這種效應(yīng)由外泌體中microRNA-365所介導(dǎo)，miR-365能夠通過上調(diào)癌細(xì)胞內(nèi)三磷酸核苷酸的水平，誘導(dǎo)胞苷脫氨酶的表達(dá)，抵抗吉西他濱的作用。研究結(jié)果也證實(shí)miR-365能夠誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌荷瘤小鼠抵抗吉西他濱的治療作用，而miR-365的拮抗劑則可以恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。研究人員還發(fā)現(xiàn)缺失Rab27 a/b的小鼠無法分泌外泌體，因此對(duì)吉西他濱的應(yīng)答顯著好于野生型小鼠。

綜上所述，這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞分泌的外泌體是胰腺導(dǎo)管腺癌抵抗吉西他濱的關(guān)鍵因素，阻斷miR-365的作用可      以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的應(yīng)答。

技術(shù)路線

結(jié)果
1. mp巨噬細(xì)胞分泌外泌體和吉西他濱耐藥性檢測(cè)

圖1

A. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的電鏡圖片。B. 外泌體的電鏡分布圖。C. WB分析來自M2極性mp巨噬細(xì)胞的外泌體。D. K989細(xì)胞、外泌體預(yù)處理和對(duì)照組與不同濃度的吉西他濱共孵育后的增殖情況。E. 不同濃度的吉西他濱處理K989細(xì)胞后的增殖情況。F. MiaPaCa-2（胰腺癌細(xì)胞系）細(xì)胞、THP-1來源的外泌體、對(duì)照組與不同濃度的吉西他濱共孵育后的增殖情況。

2. MED的篩選

圖2

A. 有或沒有染色的外泌體（綠色）的K989細(xì)胞進(jìn)行confocal，細(xì)胞膜為紅色。B. 外泌體在K989細(xì)胞內(nèi)的3D圖。C. 來源于質(zhì)膜或核的外泌體分布情況。D. 外泌體通過K989內(nèi)在化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（上），K989細(xì)胞（細(xì)胞角蛋白陽性）或基質(zhì)細(xì)胞（細(xì)胞角蛋白陰性）攝取的外泌體進(jìn)行FACS分析。E. qPCR檢測(cè)PDAC細(xì)胞（CK+），巨噬細(xì)胞（F4/80+）和基質(zhì)細(xì)胞（negative）。

3. 來源于巨噬細(xì)胞的外泌體能夠?qū)iRNA-365轉(zhuǎn)運(yùn)到PDAC細(xì)胞中，誘導(dǎo)吉西他濱耐藥

圖3

A. qPCR檢測(cè)M1和M2極性來源的外泌體的miRNAs的富集情況。B. qPCR檢測(cè)吉西他濱、吉西他濱+MDE、對(duì)照組（正常培養(yǎng)基）孵育K989細(xì)胞后的miRNA的富集。C. 在K989細(xì)胞中，不同處理后miR-365的表達(dá)變化情況。D. 不同處理后K989細(xì)胞的增殖情況。E.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖。F. miR-365在K989細(xì)胞中的表達(dá)。G. FACS分析過表達(dá)miR-365的M2極化的mp巨噬細(xì)胞共孵育的K989細(xì)胞。

4. 巨噬細(xì)胞來源的外泌體和miR-365調(diào)節(jié)嘧啶的合成和CDA表達(dá)

圖4

A.MDE或?qū)φ战M預(yù)處理的K989細(xì)胞加入吉西他濱后的LC-MS代謝組學(xué)的熱圖。B. 在K989細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-365或NC后，孵育MDE或?qū)φ战M后的LC-MS代謝組學(xué)的熱圖。C.關(guān)于a圖的信號(hào)通路富集情況。 D.LC/MS 分析加或不加MDE的K989細(xì)胞中dNTPs的濃度。E. 關(guān)于b圖的信號(hào)通路富集情況。F. LC/MS 分析轉(zhuǎn)染miR-365或NC的K989細(xì)胞中dNTPs的濃度。G. WB檢測(cè)提高NTPs濃度的K989細(xì)胞中的CDA的表達(dá)。H. qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染寡核苷酸K989細(xì)胞中的CDA的表達(dá)。I. WB檢測(cè)K989細(xì)胞中的CDA的表達(dá)。J. LC/MS 分析K989細(xì)胞、加或不加MED后的排泄物中dFdUridine的表達(dá)情況。K. MS分析K989細(xì)胞的排泄物中dFdUridine的表達(dá)情況。L. 來自K989細(xì)胞和MDE孵育后的裂解液進(jìn)行IP。

5. 在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞來源的外泌體和吉西他濱耐藥性

圖5

A. 實(shí)驗(yàn)步驟。B. 超聲測(cè)量WT 和Rab27KO小鼠在2-7周的腫瘤體積大小。C. 病理測(cè)量WT 和Rab27KO小鼠在2-7周的腫瘤體積大小。D. WT 和Rab27KO小鼠腫瘤的巨噬細(xì)胞免疫熒光（F4/80-red）。E. WT 和Rab27KO小鼠腫瘤的CDA免疫熒光。F. F4/80 細(xì)胞/體積的定量。G. CDA在e中的熒光密度。

6. 在體內(nèi)，mp巨噬細(xì)胞能夠通過攜帶miR-365加劇免疫應(yīng)答

圖6

A.將K989細(xì)胞移植Rab27KO后兩周，WT和Rab27KO小鼠來源的mp巨噬細(xì)胞（轉(zhuǎn)染NC或miR-365）注射到小鼠體內(nèi)。B. 在PDAC 腫瘤中進(jìn)行Rab27KO和CDA免疫熒光。C. 量化b圖。D. Kaplan-Meier分析。

總結(jié)

圖7. 腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)吉西他濱藥物的機(jī)制總結(jié)。

MDE能夠攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)從PDAC細(xì)胞中篩選出的miR-365。吉西他濱被轉(zhuǎn)運(yùn)到PDAC中，并且被dCK磷酸化后產(chǎn)生dFdCTP或通過CDA脫去氨基到dFdU，這會(huì)分泌到細(xì)胞外。在PDAC細(xì)胞中，miR-365上調(diào)，包內(nèi)NTP的濃度提高，這會(huì)競爭dFdCTP對(duì)DNA的結(jié)合能力。NTPs的提高也會(huì)上調(diào)CDA的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)dFdC脫氨基。