長鏈非編碼RNAs(LncRNAs)在各種人類癌癥中都出現(xiàn)失調(diào),并控制腫瘤的發(fā)生和進展。然而,LncRNAs失調(diào)的上游機制仍不清楚。這項研究證明了肝細(xì)胞核因子1同源框A反義RNA 1(HNF1A-AS1)在胃癌(GC)組織中表達顯著上調(diào)。過表達HNF1A-AS1促進細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進程,而敲除HNF1A-AS1得到的實驗結(jié)果則相反。早期生長反應(yīng)蛋白1(EGR1)直接結(jié)合HNF1-As1啟動子區(qū)域并激活其轉(zhuǎn)錄。過表達EGR1增強了細(xì)胞增殖并促進了細(xì)胞周期進程,與HNF1-As1的功能相似。HNF1A-AS1可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)與miR-661結(jié)合,上調(diào)miR-661直接靶向的細(xì)胞分裂周期蛋白34(CDC34)的表達。研究還發(fā)現(xiàn)EGR1和HNF1A-AS1可以促進細(xì)胞周期素依賴性激酶2(CDK2)、CDK4和細(xì)胞周期素E1的表達,并通過促進CDC34介導(dǎo)的p21泛素化的降解而抑制p21的表達。
綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)表明EGR1激活HNF1A-AS1調(diào)節(jié)各種促生長因子和抗生長因子以促進GC的發(fā)展,暗示它可能作為治療干預(yù)該病的靶點。
實驗路線:
實驗結(jié)果:
1. HNF1A-AS1促進細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進程
A: HNF1A-AS1在胃癌組織中高表達。B-C: HNF1A-AS1促進細(xì)胞增殖。D-G:HNF1A-AS1增加細(xì)胞代謝活性。H-I:HNF1A-AS1促進細(xì)胞非貼附性生長。J-K:HNF1A-AS1促進細(xì)胞遷移和侵襲能力。L-O:HNF1A-AS1促進腫瘤的形成。
2. HNF1A-AS1促進細(xì)胞周期進程
A: 過表達HNF1A-AS1增加S期細(xì)胞比例。B:沉默HNF1A-AS1減少S期細(xì)胞比例。C-D:過表達或沉默HNF1A-AS1細(xì)胞凋亡不發(fā)生改變。
3. EGR1直接與HNF1-As1啟動子結(jié)合
A:HNF1-As1啟動子上游2000bp序列。B:啟動子不同區(qū)域活性分析。C:啟動子結(jié)合區(qū)域活性分析。D-K: EGR1促進HNF1-As1的表達。F:HNF1-As1啟動子與EGR1結(jié)合區(qū)域引入三個點突變。G-J: EGR1直接與HNF1-As1啟動子結(jié)合。K:在人類胃癌組織中EGR1與HNF1-As1的表達正相關(guān)。
4. EGR1促進細(xì)胞增殖并加快細(xì)胞周期進程
A:EGR1促進細(xì)胞增殖。 B:EGR1增加細(xì)胞代謝活性。C:EGR1增加細(xì)胞非貼附性生長。E:EGR1促進cyclinE、CDK4、CDK2的表達,降低P21的表達。D:EGR1增加S期細(xì)胞比例。F:EGR1不影響細(xì)胞凋亡。
5. HNF1-As1促進P21的泛素化降解
A:HNF1-As1促進cyclinE、CDK4、CDK2的表達。B-C:HNF1-As1降低P21的表達。D-K: 過表達或沉默HNF1-As1不影響P21 mRNA的表達。L-M:過表達HNF1-As1降低P21的穩(wěn)定性。N-Q:過表達HNF1-As1, MG-132處理細(xì)胞后P21表達增加。 R:過表達HNF1-As1后EGR1的泛素化降解增加。S:過表達HNF1-As1小鼠癌癥組織中P21表達下降。
6. HNF1-As1通過CDC34調(diào)控P21泛素化降解
A-B:過表達CDC34導(dǎo)致P21表達下降。 C-J:過表達或沉默CDC34,P21 mRNA表達水平不發(fā)生改變。 K-N:過表達CDC34,P21的半衰期縮短。 O-P:過表達CDC34,MG-132處理細(xì)胞后內(nèi)源性P21增加。 Q:挽救實驗。沈默CDC34可以恢復(fù)由過表達HNF1-As1引起的P21蛋白的下降。
7. HNF1-As1作為ceRNA發(fā)揮作用
A:共同靶向HNF1-As1及CDC34的miRNA。B-C:miR-661和miR-663可結(jié)合HNF1-As1。 D-E:miR-661可結(jié)合CDC34.。F:只有miR-661能夠在兩種胃癌細(xì)胞系中同時降低CDC34的表達。 G-I:miR-661抑制細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。 J:RIP實驗表明miR-661可以和HNF1-As1及CDC34結(jié)合。 K-L:miR-661可以富集到HNF1-As1和CDC34。M-N:過表達CDC34后HNF1-As1表達上調(diào),沉默CDC34后HNF1-As1表達下調(diào)。
8. 作用機制圖