MiRNA 如何賣高分？--巧聯(lián)腫瘤免疫！
2018年度諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎頒給了美國科學(xué)家詹姆斯·艾利森(James P。 Allison)和日本科學(xué)家本庶佑(Tasuku Honjo)。兩位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)“抑制負免疫調(diào)節(jié)的癌癥療法”獲此殊榮。
作為全球抗腫瘤藥物市場最閃耀的明星，以PD-1、CAR-T為代表的免疫療法近幾年風(fēng)靡全球，國內(nèi)研發(fā)熱情空前。此次諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒給了免疫療法先驅(qū)，相關(guān)研究也有望在明年基金申請上變得更加受寵。
如何將腫瘤免疫治療與當下其他熱門的研究關(guān)聯(lián)起來？
首先看下今年中標基金PD-1研究情況：
1. PD-1/PDL-1與非編碼RNA:
2. PD-1/PDL-1與自噬:
接下來介紹一篇miRNA調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的文章：
“microRNA 125a Regulates MHC-I Expression on Esophageal Adenocarcinoma Cells, Associated With Suppression of Antitumor Immune Response and Poor Outcomes of Patients”18年9月份發(fā)表在Gastroenterology（IF:20）上。
該研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞系和腫瘤組織中， MIR125a-5p和MIR148a-3p水平增加可降低抗原呈遞所需的TAP2和MHC-I的水平。食管癌高表達的MHC-I分子與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的標記物相關(guān)，且顯著縮短患者的總體生存時間。
該文章機制簡單：miRNA-靶向MHC-I通路上的TAP2。
樣本：兩株細胞系，51個食管癌病人包埋癌組織，及病人信息。
研究手段只涉及一些常規(guī)實驗：RNA-seq, qPCR, wb, 熒光素酶報告基因?qū)嶒?，流式，細胞毒性實驗。生信分析：基因集富集分析；統(tǒng)計學(xué)：Cox回歸分析通路與OS和RFS的關(guān)系， KM生存分析。
主要研究方案：
1. 尋找差異表達MHC-I 通路的食管癌細胞系
為確定食管癌中MHC-I基因表達的潛在調(diào)控機制，首先使用兩個食管癌細胞系:OE33和OE19。之前PCR證明 OE33和OE19細胞在參與抗原呈遞機制的TAP1和TAP2表達上存在差異。
這里作者進一步驗證TAP1、TAP2和HLA-B 的RNA和蛋白質(zhì)水平在OE19中較OE33中低表達(圖1 A-C)。
MHC通路激動劑IFNG處理OE19細胞后，這幾個基因表達增加（(圖1D）。使用細胞芯片證實該通路在OE19細胞中下調(diào)（圖1E）。
2. 篩選OE33和OE19細胞中差異miRNA
qPCR芯片檢測88個調(diào)控免疫的miRNA在這兩株細胞中的表達（圖2A）
對OE19細胞中上調(diào)的7個miRNA進行單個PCR，都獲得驗證（圖2B）。
而結(jié)合位點預(yù)測只發(fā)現(xiàn)MIR125a-5p和MIR148a-3p靶向MHC-I通路中的基因（圖2C），其中MIR148a-3p已被報道。
熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證MIR125a-5p靶向TAP2（圖2D、E）
3. 驗證MIR125a-5p和MIR148a-3p對靶基因的調(diào)控，導(dǎo)致免疫逃逸
MIR125a-5p mimics 轉(zhuǎn)染OE33細胞，qPCR和WB驗證 靶基因TAP2表達下調(diào)（圖3A、B）
流式細胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染MIR125a-5p或MIR148a-3p后，MHC-I細胞表面表達下降(圖3C)
驗證MHC通路激動劑IFNG對這兩個miRNA的調(diào)控：IFNG處理后，MHC-I缺陷的OE19細胞中兩種miRNA水平顯著降低(圖3D)。解釋了圖1中，IFNG處理后TAP2等上調(diào)情況。
接下來，作者研究由MIR125a-5p和MIR148a-3p誘導(dǎo)的TAP2和MHC-I表達降低是否對特異性CTL識別和殺傷腫瘤細胞有功能影響。MIR125a-5預(yù)轉(zhuǎn)染降低T細胞誘導(dǎo)的細胞毒性(圖3E)
食管癌組織MIR125a-5p原位雜交和TAP2免疫組化驗證表達及兩者相關(guān)性（圖4）
4. MHC-I通路表達與抗腫瘤免疫應(yīng)答及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系
作者使用一個整合基因表達(51個病人RNA-seq)、生存數(shù)據(jù)和通路的疾病分型管道（圖5A）。
發(fā)現(xiàn)能夠反映MHC-I介導(dǎo)的抗原呈遞 的通路位于前3個的免疫相關(guān)通路，且能將患者分為兩組，生存率顯著差異（圖5B）。
KM生存率分析顯示，抗原呈遞途徑的高表達與新輔助放化療后手術(shù)切除患者的不良RFS和OS相關(guān)（圖5C、D）。
將低表達和高表達上述基因的患者進行KM生存率分析，結(jié)果顯示，TAP1高表達與不良OS相關(guān)，而TAP1、TAP2和HLA-A與不良RFS相關(guān)（圖5E、F）;
利用基因集富集分析“抗原呈遞”途徑的表達，定義MHC-I“低”和“高”患者亞群 （5G），MHC-Ihigh亞群，與臨床反應(yīng)抗PD-1 相關(guān)（圖5H）, 而高表達PD-L1, PD-L2, and IDO1與不良RFS相關(guān)（圖5I-K）,高表達PD-L1與不良OS相關(guān)（圖L）
5. 食管癌中腫瘤免疫微環(huán)境的IHC鑒定
最近的研究表明，結(jié)合基因表達譜和免疫組化在預(yù)處理活檢中提高了預(yù)測免疫治療反應(yīng)的準確性。為在蛋白水平上分析所用食管癌樣本的腫瘤免疫微環(huán)境，作者對石蠟包埋組織進行了CD8A、PD-1、PD-L1和PD-L2的IHC分析。與RNA-seq分析結(jié)果一致，與未復(fù)發(fā)的患者相比，復(fù)發(fā)且MHC-I表達較高的患者腫瘤中CD8A、PD-1、PD-L1、PD-L2陽性細胞增多。
