低氧腫瘤外泌體miRNA通過巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

胰腺癌（PC）是一高度惡性的腫瘤，預(yù)后極差。未接受治療的胰腺癌病人的生存期約為4個月。PC患者的高死亡率主要是由于早期診斷困難、局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移。因此，發(fā)現(xiàn)新的診斷生物標(biāo)志物和更好地理解PC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是至關(guān)重要的。腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，其中缺氧和炎性細(xì)胞浸潤是導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變的重要因素。外泌體可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過傳遞其內(nèi)容物在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。最近有研究表明，缺氧可能通過改變外泌體的釋放來調(diào)節(jié)細(xì)胞間的溝通從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。來自腫瘤細(xì)胞的外泌體通過腫瘤和周圍基質(zhì)組織之間的傳遞、增殖和血管生成通路的激活、轉(zhuǎn)移前位點(diǎn)的啟動和免疫抑制的形成等，都有助于腫瘤的發(fā)展。2018年8月上海交通大學(xué)裴正軍課題組在Cancer Res（IF=9.13）上發(fā)表論文，探討了胰腺癌外泌體如何在低氧條件下調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)育的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞在低氧微環(huán)境中產(chǎn)生富含mir-301a-3p的外泌體，并通過HIF-1a和HIF-2a依賴性方式激活巨噬細(xì)胞形成Ｍ2亞型，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移，侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.缺氧促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞分泌外泌體并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖1

A:正常組和缺氧組胰腺癌細(xì)胞PANC1分泌的外泌體電鏡鑒定（凹陷半球形）；B、C：外泌體NAT鑒定（顆粒直徑30-150nm）；D、E：外泌體WB鑒定（外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD81、TSG101、HSP70、ALIX、Flotillin-1）；F：免疫組化（IHC）檢測CD9在PC組織中的表達(dá)高于正常組織；G、H: PMA誘導(dǎo)后，THP-1細(xì)胞由單核細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞，并檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)；I： PKH67標(biāo)記PANC1來源的外泌體孵育巨噬細(xì)胞，被標(biāo)記的外泌體被巨噬細(xì)胞內(nèi)化；J:PBS組、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組，IL-4組檢測M2和M1極化的標(biāo)志物，其中IL-4組為陽性對照組，M2極化的標(biāo)志物在PANC1-H-exo組明顯升高；K:WB檢測M2極化的標(biāo)志物CD206和Arginase-1；L:人骨髓來源巨噬細(xì)胞（HBMDM）形態(tài)學(xué)檢測；M：流式檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD11b）在HBMDM中的表達(dá)；N:PBS組、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組檢測HBMDM標(biāo)志物PANC1-H-exo組CD206和Arginase-1明顯升高；O:siHIF-1α后，、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組CD206和Arginase-1的表達(dá)；p:免疫組化檢測CD163在胰腺癌中表達(dá)。

2.缺氧外泌體極化的M2巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)PC細(xì)胞的侵襲遷移以及上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖2

A:體外間接共培養(yǎng)示意圖；B、C:BMPC-3細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共孵育，經(jīng)過不同的方法處理后，檢測細(xì)胞遷移和侵襲，缺氧處理的BMPC-3細(xì)胞的外泌體與巨噬細(xì)胞共孵育可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移； D、E、F、G：缺氧的腫瘤細(xì)胞的外泌體與巨噬細(xì)胞共孵育可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移；H、I、J:缺氧PANC-1細(xì)胞分泌的外泌體與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24h后， BMPC-3細(xì)胞丟失了細(xì)胞間連接，延長了細(xì)胞假足，變成了紡錘狀形態(tài)，此外,上皮細(xì)胞標(biāo)記物(E-cadherin)表達(dá)降低，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(N-cadherin, Vimentin, MMP7)表達(dá)升高 K、L、M::結(jié)果與H,I,J一致。

3.miR-301a在缺氧PC細(xì)胞外泌體中高度表達(dá)，并可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中。

圖3

A、B:qRT-PCR檢測PC細(xì)胞外泌體中正常和缺氧狀態(tài)下miR-301a的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧后miR-301a含量升高；C、D：siRNA敲除BxPC-3和PANC-1細(xì)胞中HIF-1α, HIF-2α后，qRT-PCR檢測PC細(xì)胞外泌體中正常和缺氧狀態(tài)下miR-301a的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siHIF-1α,si HIF-2α后，miR-301a的水平明顯降低，說明miR-301a的水平是依賴HIF-1α, HIF-2α的；E:PC患者血清中的miR-301a的水平高于正常對照組；F:生存分析顯示miR-301a高表達(dá)的患者的生存率低于miR-301a低表達(dá)的患者；J:miRNA-301a是胰腺癌患者除年齡、性別等預(yù)測存活率的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)；H：低氧外泌體孵育的巨噬細(xì)胞表達(dá)的miR-301a高于正常外泌體和PBS組；I：用正常PC細(xì)胞上清液和PC細(xì)胞超離心（無外泌體）細(xì)胞上清液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48h,qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞中miR-301a水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此時miR-301a表達(dá)明顯降低；J:提取PC細(xì)胞外泌體中總RNA孵育巨噬細(xì)胞，此時巨噬細(xì)胞中miR-301a表達(dá)明顯升高。

4.外泌體miR-301a-3p誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，促進(jìn)PC細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 。

圖4

A、B:敲除PANC-1細(xì)胞中miR-301a，NAT檢測外泌體顆粒大小和濃度，低氧處理后的外泌體大小并未明顯改變但miR-301a敲除后外泌體納米粒子的相對濃度明顯下降；C:WB鑒定外泌體標(biāo)志蛋白,敲除組外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)含量下降；D: qRT-PCR檢測到，miR-301a敲除的PANC-1細(xì)胞及外泌體中miR-301a表達(dá)明顯下調(diào)；E:低氧外泌體培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物的表達(dá)也明顯降低；E:轉(zhuǎn)染miR-301a mimics,M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物又顯著升高；G、H、I、J:轉(zhuǎn)染miR-301a mimics的巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)PC的遷移和侵襲；K、L、M: 轉(zhuǎn)染miR-301a mimics的巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

5.外泌體miR-301a通過下調(diào)PTEN表達(dá)，激活PI3Kγ信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖5

A、B、C、：雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證靶基因PTEN：D、E:PCR，WB檢測PTEN的基因和蛋白表達(dá)情況；F、G:PC細(xì)胞外泌體與巨噬細(xì)胞共孵育,檢測PC細(xì)胞中PTEN, PI3K γ, p-AKT，AKT，p-mTORand mTOR蛋白表達(dá)水平,驗(yàn)證缺氧PC細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)PI3K γ通路的激活；H、I: 缺氧PC細(xì)胞外泌體miR-301a可以促進(jìn)PI3K γ通路的激活；J、K: PI3K γ敲除CD206, p-AKT，p-mTOR蛋白表達(dá)含量降低；L、M: PI3K γ敲除后，PANC-1細(xì)胞侵襲遷移減少；N、O: PI3K γ敲除后,轉(zhuǎn)染miR-310amimics后，PANC-1細(xì)胞侵襲遷移增多。

6. 外泌體miR-301a-3p通過在體內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化促進(jìn)PC細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

圖6

A:小鼠尾靜脈注射PC細(xì)胞的外泌體在正常調(diào)件以及缺氧后分別注入巨噬細(xì)胞或miR-301amimics轉(zhuǎn)染進(jìn)PC細(xì)胞并與巨噬細(xì)胞混合后一同注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，檢測肺轉(zhuǎn)移情況；B:各組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)；C:將巨噬細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞注射進(jìn)小鼠尾靜脈后，裸鼠的體重變化；D:缺氧外泌體miR-301a促進(jìn)巨噬細(xì)胞和胰腺癌轉(zhuǎn)移的示意圖。