開采lncRNAs巨大寶藏的神兵利器--CRISPR-Cas9 Screen
近期，癌癥研究頂級期刊Cancer Cell發(fā)表了來自瑞士伯尼爾大學的Rory Johnson教授的綜述：通過CRISPR-Cas技術(shù)篩選具有治療潛力的的長鏈非編碼RNA。該文總結(jié)了新發(fā)表使用CRISPR的技術(shù)篩選與腫瘤細胞增殖和抗藥性相關(guān)lncRNAs的研究論文；并著重介紹了這一高通量、高特異性篩選方法的策略、材料和方法。小編在這和大家一起分享。
LncRNAs（long non-coding RNAs，長鏈非編碼RNA）是一類長度在200 nt以上，不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA。它們參與眾多的生物學過程，也是目前癌癥研究中的熱門內(nèi)容。其數(shù)量遠超過蛋白編碼基因，達到50000甚至更多。高通量測序方法為我們發(fā)掘新的lncRNAs提供了極大的支持。通過基因測序檢測突變或全轉(zhuǎn)錄組檢測表達量變化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多癌癥相關(guān)的lncRNA。如NETA1在多數(shù)實體瘤中表達量均上調(diào)并有促癌癥作用(Chakravarty, Sboner et al. 2014)。此外，基于RNAi的shRNA文庫篩選也是常使用的方法。然而單純表達量差異的篩選無法與功能聯(lián)系起來。因此，利用CRISPR-Cas9的功能性高通量篩選技術(shù)研究lncRNAs成了我們的一大利器。早在2014年，張峰課題組就報道了針對所有蛋白編碼基因的CRISPR-Cas9篩選文庫(Shalem, Sanjana et al. 2014)；這一方法目前在研究中也廣泛使用。之后研究人員在此基礎上推出了針對不同基因群的亞庫、攜帶不同活性的融合蛋白的激活或抑制文庫等。近年來，許多高水平文章報道了通過該方法發(fā)現(xiàn)參與各中生物學過程的新基因。而針對lncRNAs的高通量文庫在2018年才有報道(Liu, Cao et al. 2018)。接下來讓我們來學習整個實驗的設計思路。
圖1 CRISPR-Cas Screen文庫構(gòu)建、感染和篩選模式圖
如圖1所示，我們首先需要設計或購買符合我們研究目標的sgRNA文庫。例如Addgene 89640、 86538–86550、1000000106等，都十分方便研究者直接使用。這些文庫針對每一個lncRNA均設計6條sgRNA來提高結(jié)果的準確性。然后包裝病毒后感染細胞建立穩(wěn)定表達相應Cas9蛋白和gRNA的細胞系。需要注意的是，使用含gRNA的病毒感染細胞時，MOI值應較低（應低于1，該文章推薦值為0.3），這樣才能保證單個細胞中只有單個lncRNA被編輯。通過抗生素等篩選方法去除未感染細胞后，便可以進行篩選實驗了。
我們根據(jù)研究目的制定特定篩選策略。根據(jù)不同lncRNAs編輯后產(chǎn)生的不同表型篩選出目標組別和對照組別。如根據(jù)侵襲能力不同分選出高侵襲能力的細胞和低侵襲能力的細胞；藥物處理后根據(jù)耐藥性分選不同表型的細胞；根據(jù)帶GFP熒光標簽的目標蛋白的含量篩選目標蛋白上調(diào)或下調(diào)的細胞類群。嚴格的篩選標準和合理的對照設置能使我們的篩選結(jié)果更加準確有效。接下來便是檢測各自細胞亞群中有哪些lncRNAs被編輯。
圖2 CRISPR-Cas Screen篩選后測序檢測和分析模式圖
提取相應細胞基因組并使用特異性引物PCR出整合的sgRNA序列后構(gòu)建二代測序文庫測序，再通過生物信息學分析樣品中g(shù)RNA豐度，豐度變化的gRNA所對應的lncRNA便是調(diào)控篩選條件過程的潛在分子靶標。如此得到的靶標均是在癌癥發(fā)生過程中有調(diào)節(jié)功能的lncRNA，在經(jīng)過分析和篩選后部分指標并驗證其功能后，便是你深入探究分子機制、大展身手的最佳時機。下面舉例展示部分文章的篩選和驗證結(jié)果(Zhu, Li et al. 2016)，如圖3所示。文章在Huh7OC細胞中篩選了700個lncRNAs，發(fā)現(xiàn)其中51個能上調(diào)或下調(diào)該細胞的生長。驗證實驗中敲除AC004463.6（圖3 f中粉色標注）后，癌細胞的生長受到顯著抑制；敲除LINC01087（圖3 g中紅色標注）后，癌細胞的生長顯著增加。當然，這種方法中也會存在著敲除作用是否高效，功能性篩選結(jié)果的機制研究困難等問題。
圖3 部分篩選指標驗證結(jié)果
上海英拜生物多年來一直聚焦于lncRNA、miRNA、cirRNA研究的前沿，在測序篩選、機制功能研究方面均有著豐富的經(jīng)驗和眾多成功案例。更多資訊可查詢公司相關(guān)產(chǎn)品。