類風(fēng)濕與腸道菌群不可告人的秘密

腸道菌群近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)，并在許多生命過程中發(fā)揮著重要的作用，例如參與自身免疫進(jìn)程，與神經(jīng)發(fā)育的聯(lián)系。近期，微生物頂級期刊Microbiome發(fā)表了一篇題名為：單一細(xì)菌種恢復(fù)微生物生態(tài)失調(diào)，保護(hù)大鼠模型骨骼免受類風(fēng)濕破壞的文章。該文章主要通過宏基因組鳥槍法測序和宏基因組關(guān)聯(lián)研究，評估了干酪乳桿菌對佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型腸道微生物群和免疫功能紊亂的影響。

   對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者進(jìn)行早期治療是優(yōu)化藥物治療成功的關(guān)鍵，目前在關(guān)節(jié)炎前期階段阻斷骨質(zhì)破壞進(jìn)展的治療效果仍然不能令人滿意。RA患者的微生物紊亂通過有效干預(yù)治療顯著逆轉(zhuǎn)。將異常腸道微生物組調(diào)節(jié)到健康狀態(tài)是預(yù)防骨損傷的潛在治療方法。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.干酪乳桿菌顯著減輕佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎
  對SD大鼠灌喂干酪乳桿菌菌株ATCC334和甲氨蝶呤(MTX)，在同一天用完全弗氏佐劑（CFA）進(jìn)行關(guān)節(jié)炎造模。經(jīng)過三十天干預(yù)后，用干酪乳桿菌和MTX治療的大鼠表現(xiàn)出較少的癥狀加劇。此外，干酪乳桿菌發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎作用而不遷移到腸道以外的地方，因?yàn)楦衫胰闂U菌是兼性厭氧細(xì)菌，并且在干酪乳桿菌處理的動物中未檢測到菌血癥。通過微型CT發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌處理的大鼠的踝部的骨侵蝕減少，膝關(guān)節(jié)的組織切片觀察結(jié)果與微型CT一致，并且干酪乳桿菌處理的大鼠膝關(guān)節(jié)的病理評分和踝關(guān)節(jié)的放射學(xué)評分顯著改善。這些數(shù)據(jù)表明，干酪乳桿菌的給藥能夠減輕實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎并保護(hù)骨骼免受侵蝕。

Fig1.干酪乳桿菌減輕佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎。顯示干酪乳桿菌對關(guān)節(jié)炎評分（a）和增加的后爪體積（b）的影響（每組n = 7）。a和b的數(shù)據(jù)被示為平均值±SEM，不同組的數(shù)據(jù)通過雙向ANOVA分析組間差異（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。腳踝的照片，X射線和微CT圖像顯示在c中。在d中顯示了不同組中大鼠膝關(guān)節(jié)病理切片的代表性圖像。通過病理學(xué)評分e評估病理結(jié)果。分別使用micro-CT圖像和micro-CT分析儀評估放射學(xué)評分和微CT評分（f，g）。在數(shù)據(jù)e，f，和g被示為平均值±SEM，組之間的差異通過單向ANOVA進(jìn)行分析。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。骨破壞水平的積分評估顯示在（h）。數(shù)據(jù)顯示為平均值并分為幾個(gè)級別。0-0.2：正常; 0.2-0.4：輕微（Lig）; 0.4-0.6：中等（Mod）; 0.6-0.8：嚴(yán)重（Sev）; 0.8及以上：非常嚴(yán)重。正常，正?？刂? 模型，疾病控制; MTX，甲氨蝶呤
2.干酪乳桿菌可預(yù)防由關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)引起的腸道生態(tài)失調(diào)
   由于缺乏明確定義的RA相關(guān)微生物群特征，因此選取五個(gè)時(shí)間點(diǎn)（TP）收集了四組的糞便樣本，并通過使用鳥槍法宏基因組測序確定了關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中微生物組的動態(tài)變化。五個(gè)TP包括第0天，AIA誘導(dǎo)前（TP1），第7天（關(guān)節(jié)炎前時(shí)間點(diǎn)）（TP2），第14天（TP3），第21天（TP4）和第30天（TP5）。在TP3，表明干酪乳桿菌可以在早期補(bǔ)救揮發(fā)性腸道生態(tài)失調(diào)。在TP5，伴隨著在干酪乳桿菌組中觀察到的關(guān)節(jié)炎的緩解，腸道微生物組的組成顯著接近HP而不是DP表明關(guān)節(jié)炎中的生態(tài)失調(diào)可以被干酪乳桿菌逆轉(zhuǎn)，最終有助于改善腸道菌群。關(guān)節(jié)炎評分與HP的距離呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)= 0.48，P = 0.015），與DP的距離呈負(fù)相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)= -0.46，P = 0.019）。

Fig2.隨著時(shí)間的推移，干酪乳桿菌 / MTX處理的大鼠腸道微生物群組成的動態(tài)變化。顯示了在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對于干酪乳桿菌/ MTX處理的大鼠的每個(gè)樣品的健康平面（HP）和模型平面（DP）的距離。線條的顏色對應(yīng)于不同的樣品，厚度反映了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。通過配對t檢驗(yàn)分析HP和DP之間的差異
3.干酪乳桿菌治療佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠中紊亂的微生物組
  選擇了25種微生物，其中毛螺菌，奇異變形桿菌和棒狀桿菌支原體已發(fā)現(xiàn)可能與RA相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)化處理所鑒定的25種微生物的相對豐度，然后與TP1相比，在每個(gè)TP處顯示Log10倍數(shù)的變化。
  進(jìn)一步研究了干酪乳桿菌處理的AIA大鼠中關(guān)節(jié)炎相關(guān)菌種的改變。與模型組中的大鼠不同，包括不動桿菌，干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的微生物群被上調(diào)，并且解脲支原體，脫硫弧菌和二硫化嗜血桿菌細(xì)菌被下調(diào)。值得注意的是，這些改變發(fā)生在干酪乳桿菌ATCC334沒有持續(xù)定植的情況下，因?yàn)槲覀儧]有檢測到從干酪乳桿菌處理的大鼠分離的糞便樣品中干酪乳桿菌的富集。然而，其他乳酸桿菌種類相對豐度上調(diào)或恢復(fù)到正常水平，這表示干酪乳桿菌在抑制關(guān)節(jié)炎中的功能與其調(diào)節(jié)微生物組，特別是其他乳桿菌菌株的功能密切相關(guān)。

Fig3.Log10與TP1的樣品進(jìn)行比較關(guān)節(jié)炎相關(guān)物種中的TP5的相對豐度的倍數(shù)變化?？虮硎镜谝缓偷谌姆治粩?shù)之間的中位數(shù)和四分位數(shù)間（IQR）; 胡須代表從第一或第三四分位數(shù)的1.5倍IQR內(nèi)的最低值或最高值。圓圈代表樣本。重要的倍數(shù)變化標(biāo)有星號
4.抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與受干酪乳桿菌給藥影響的細(xì)菌的豐度相關(guān)
  細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，因此，確定血清中IFN-γ，TNF-α和IL-1β，IL-17，IL-2和IL-6的水平并確定干酪乳桿菌治療AIA大鼠后促炎細(xì)胞因子水平與腸道微生物群改變的相關(guān)性。結(jié)果顯示，與造模組AIA相比，干酪乳桿菌處理的AIA大鼠中促炎細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-17和IL-6的水平顯著降低。干酪乳桿菌處理的動物中，分別由活化的適應(yīng)性和先天性免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IL-1β水平顯著降低。這些結(jié)果表明干酪乳桿菌對AIA大鼠的作用與治療相關(guān)微生物對促炎細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用相關(guān)。

Fig4.干酪乳桿菌通過嗜酸乳桿菌的復(fù)活抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。a使用ELISA評估血清中細(xì)胞因子（IL-17，IL-1β，TNFα，IL-6，IFN-γ，IL-2）的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±sem和min，max。通過單向ANOVA分析組之間的差異。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。b 嗜酸乳桿菌豐度與血漿細(xì)胞因子的關(guān)系。cc，Spearman在調(diào)整體重，組和關(guān)節(jié)炎評分后的相關(guān)系數(shù)
5. 干酪乳桿菌保持氧化還原平衡參與AIA大鼠RA的改善
  為了探索干酪乳桿菌給藥有益效果背后的潛在機(jī)制，使用KEGG數(shù)據(jù)庫對L. casei和MTX處理的大鼠的腸道微生物組中的功能模塊進(jìn)行了綜合分析。與微生物群的改變導(dǎo)致宿主代謝和氧化還原平衡變化的觀點(diǎn)一致，發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑的功能模塊，包括氧化階段，在AIA大鼠中得到增強(qiáng)，這與先前有關(guān)RA患者報(bào)告的結(jié)果一致。用干酪乳桿菌治療后，磷酸戊糖途徑中涉及的豐富基因減少，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）醌氧化還原酶，同化硫酸鹽還原，NADH泛醌氧化還原酶，β-氧化和脂肪酸生物合成模塊中涉及的豐度基因增加，表明干酪乳桿菌通過調(diào)節(jié)免疫代謝和氧化還原能力發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎作用。

Fig5.干酪乳桿菌維持氧化應(yīng)激的氧化還原平衡。與來自MTX，干酪乳桿菌和模型組的TP1樣品相比，TP5處免疫相關(guān)KEGG模塊的豐度的平均log 2倍變化。KEGG orthology group模塊和組按無監(jiān)督層級聚類排序。青色，減少模塊; 紅色，增加模塊。未繪制一個(gè)或多個(gè)組中缺少的模塊
結(jié)論
      通過在AIA大鼠中使用時(shí)間序列研究方案來鑒定腸道微生物組的組成和功能改變，并且結(jié)果支持調(diào)節(jié)微生物群可以作為預(yù)防和治療人類RA的新策略的結(jié)論。這些結(jié)果是在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中獲得的，并且非常需要在RA患者中進(jìn)行深入研究。必須進(jìn)一步闡明益生菌的預(yù)防/治療作用背后的精確分子機(jī)制，并且需要對腸中鑒定的細(xì)菌標(biāo)記物進(jìn)行集中驗(yàn)證。這為RA研究和治療提供了新的研究方向和治療思路。