腫瘤中的拉鋸戰(zhàn)——蛋白質(zhì)和circRNA的拮抗作用

近期，Dr. Guarnerio J等人在雜志《Cell Research》上發(fā)表了一篇題為“Intragenic antagonistic roles of protein and circRNA in tumorigenesis”的文章，其影響因子為17.848。該研究針對(duì)Pokemon蛋白和circPOK的在間質(zhì)腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行了研究，探究它們的異常表達(dá)與包括癌癥在內(nèi)的疾病發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系。
      circRNAs產(chǎn)生于mRNA加工過程中的反向剪接事件，當(dāng)解除調(diào)控時(shí)可以在癌癥中發(fā)揮積極作用。在此，我們描述了一種在間質(zhì)腫瘤惡化的情況下由Zbtb7a基因(也被稱為Pokemon，LRF)編碼的新的circRNA(circPOK)。circPOK作為一種非編碼的原癌RNA獨(dú)立于其線性轉(zhuǎn)錄物，功能與其通過編碼Pokemon轉(zhuǎn)錄因子起到腫瘤抑制因子作用的線性轉(zhuǎn)錄物相反。我們發(fā)現(xiàn)circPOK通過共激活I(lǐng)LF2/3復(fù)合物來調(diào)節(jié)促增殖和促血管生成因子。重要的是，Pokemon蛋白和circRNA的表達(dá)在癌癥中通過差異轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)后異常解耦合。因此，我們確定了一種新型的基因單位，iRegulon，它產(chǎn)生具有不同生物化學(xué)性質(zhì)，功能不同且對(duì)立的環(huán)形和線形的RNA產(chǎn)物。我們的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)大了細(xì)胞控制正常的生物輸出的功能范圍，而這些成分的異常表達(dá)可能是包括癌癥在內(nèi)的疾病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。
技術(shù)路線總結(jié)：


結(jié)果：
1.CircPOK起源于Zbtb7a外顯子2的反向剪接
      作者對(duì)總RNA進(jìn)行RNase R處理，降解線性轉(zhuǎn)錄本，保留環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。圖1a為小鼠circPOK在原代p53 - / - MSCs中的表達(dá)分析，雖然RNase R處理顯著減少了線性轉(zhuǎn)錄本(LinPOK)，但由兩組獨(dú)立引物(circPOK_PR1和circPOK_PR2)測(cè)得的circPOK保持不變。圖1b為人circPOK在HS5間充質(zhì)細(xì)胞系中的表達(dá)分析。為了評(píng)估Zbtb7a的線性剪接事件和反向剪接事件的比率，研究者在小鼠MSCs內(nèi)對(duì)線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了絕對(duì)量化，如圖1c所示。研究者們開發(fā)了一種通過原位雜交實(shí)現(xiàn)circRNA可視化的新方法(circFISH，圖1d)以研究circPOK在間充質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。Zbtb7a的三個(gè)外顯子中的每一個(gè)都被標(biāo)記有不同熒光報(bào)告子的探針平鋪。對(duì)于外顯子1和3(包含在線性轉(zhuǎn)錄本中但不包含在環(huán)形轉(zhuǎn)錄本中)退火探針使線性轉(zhuǎn)錄本(圖1中的紅色信號(hào))能夠可視化，而針對(duì)外顯子2(圖1中的綠色信號(hào))的探針使線性轉(zhuǎn)錄本和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本可以被區(qū)分。通過分析兩種報(bào)告子的共定位，我們能夠區(qū)分單個(gè)線性轉(zhuǎn)錄本(圖1中的黃色信號(hào))和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本(圖1中的綠色信號(hào))(圖1d-f)。以circPOK-null細(xì)胞(圖1e中的Cre細(xì)胞)或circPOK敲除細(xì)胞(圖1f中的shCircPOK細(xì)胞)作為對(duì)照。研究者們使用這種新的circFISH方法(圖1e，f)觀察到circPOK同時(shí)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，這也通過核/細(xì)胞質(zhì)分離后的RT-qPCR分析證實(shí)(圖1g，h)。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)表明circPOK是一種真正的circRNA，在間充質(zhì)細(xì)胞和腫瘤中表達(dá)，并且定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在那里它可能發(fā)揮功能作用。

2.CircPOK和Pokemon蛋白在間質(zhì)腫瘤中是解耦合的，它們?cè)谄渲邪l(fā)揮獨(dú)立的作用
      研究者們通過RT-qPCR分析未分化肉瘤和骨肉瘤中線形和環(huán)狀Pokemon的表達(dá)，并將結(jié)果與正常組織相比較。如圖2a所示，觀察到LinPOK和circPOK在腫瘤中的差異表達(dá)趨勢(shì)。
      圖2b為Zbtb7aF/F位點(diǎn)的示意圖。在用CRE表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將這些從小鼠體內(nèi)提取的MSCs中的Pokemon蛋白和circPOK刪除。為了確定circPOK的可能功能，首先分離出p53-/-Zbtb7a_ex2f/F MSCs，并用表達(dá)Cre-重組酶的慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)它們，該慢病毒載體缺失Zbtb7a_ex2(圖2b)。隨后，將circPOK(circPOK-GTG載體)或Pokemon蛋白(CDNA Pok)添加回空白MSCs(圖2c，d)，以研究circRNA和蛋白質(zhì)的具體作用。通過采用這種Add back方法，能夠在Zbtb7a缺失細(xì)胞中重新表達(dá)Zbtb7a的線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，并獲得與野生型p53-/-MSCs中測(cè)量的正常內(nèi)源性水平相當(dāng)?shù)木€性和環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平(圖2d)。使用這個(gè)Pokemon-蛋白質(zhì)翻譯起始密碼子ATG誘變載體(circPOK-GTG)在所有的實(shí)驗(yàn)中表達(dá)circPOK。用所有這些載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代p53-/-Zbtb7a_EX2F/F-Cre MSCs進(jìn)行體外和體內(nèi)試驗(yàn)?；趯SCs植入同源小鼠的3D支架內(nèi)的方案(圖2e) ，進(jìn)一步研究circPOK是否以及如何在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤的形成。左邊是體內(nèi)腫瘤發(fā)生實(shí)驗(yàn)的示意圖；中間的圖表為空白載體，circGFP，cDNA Pok-gfp，circPOK和circPOK-SDmut載體中p53-/-Zbtb7a_EX2F/F-CRE MSCs生成的腫瘤的相對(duì)大?。挥覀?cè)為H&E和Ki-67染色腫瘤切片的代表性圖片。
      這些實(shí)驗(yàn)表明circPOK和Pokemon蛋白可能在間質(zhì)腫瘤中發(fā)揮獨(dú)立和相反的作用。雖然Pokemon蛋白在間質(zhì)腫瘤中起到腫瘤抑制因子的作用，但是circPOK可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤形成的原癌功能。

3.CircPOK在間充質(zhì)腫瘤中起原癌作用
  為了測(cè)試circPOK是否真的可以作為間質(zhì)腫瘤中的原癌因子，研究者在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中針對(duì)p53-/- MSCs中的circPOK。圖3a為用于選擇性針對(duì)circPOK或LinPOK的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理圖。僅針對(duì)LinPOK轉(zhuǎn)錄本的shRNA被表示為SH3‘-UTR，針對(duì)線性和環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的shRNAs表示為shEx2。為每個(gè)目標(biāo)設(shè)計(jì)了三個(gè)shRNAs，選擇了其中兩個(gè)具有較強(qiáng)OnTarget活性的shRNA進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)(圖3b)。如圖3c所示，在錨定非依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，僅線性轉(zhuǎn)錄物(sh3‘-UTR)表達(dá)丟失的p53-/- MSCs能夠比兩種RNA亞型表達(dá)丟失的細(xì)胞(Shex2)形成更大的集落。圖3d為通過針對(duì)circRNA back-splice剪接點(diǎn)的shRNA或LNAs阻斷circPOK表達(dá)的策略原理概述。圖3e為小鼠MSCs(ShCircPOK)中用shRNAs敲除circPOK后circPOK和LinPOK的表達(dá)水平(shCircPOK)。當(dāng)circRNA在表達(dá)circPOK的p53-/-MSCs中沉默時(shí)，在正常和錨定非依賴性生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞顯示出明顯的增殖潛能受損(圖3f)。除了靶向背接連接的shRNA外，研究者們?cè)讵?dú)立和互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)中使用LNA-Gapmer專門針對(duì)circPOK(圖3g)。與shCircPOK觀察結(jié)果一致，當(dāng)LNAs削弱circPOK的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞增殖顯示出下降(圖3h)，這證實(shí)了研究者們的假設(shè)，即特異性靶向circPOK可以有益于肉瘤的治療。

4.CircPOK與核RNA結(jié)合蛋白相互作用
      為了研究circPOK通過直接結(jié)合來調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白的功能，研究者們通過體外轉(zhuǎn)錄測(cè)定(起源于circPOK)對(duì)Zbtb7a外顯子2進(jìn)行生物素化，使用抗生物素磁珠將其下拉，并對(duì)下拉進(jìn)行質(zhì)譜分析，以鑒定預(yù)測(cè)的circPOK相互作用蛋白。圖4a為與Zbtb7a_Ex2相互作用的RNA結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析，Zbtb7a_Ex2是通過體外轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)產(chǎn)生的。ILF2和ILF3被選為目標(biāo)。
      假設(shè)circPOK可以通過調(diào)節(jié)ILF2和ILF3致癌功能發(fā)揮作用。研究者將circRNA可視化的circFISH協(xié)議與ILF3蛋白的免疫熒光染色相結(jié)合，證明了circPOK可以與細(xì)胞核中的ILF2/3復(fù)合物共定位(圖4b)。通過ChIRP(RNA純化的染色質(zhì)分離)分析下拉內(nèi)源性circPOK，并對(duì)下拉材料進(jìn)行western blot分析以檢測(cè)ILF2和ILF3蛋白(圖4c)。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)源性circPOK可以與MSCs中的ILF2和ILF3相互作用。這些相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞核中，ILF2和ILF3主要集中在細(xì)胞核中。
      研究者們進(jìn)行了ELISA以研究circPOK通過ILF2/3調(diào)節(jié)間充質(zhì)腫瘤細(xì)胞的“分體組”的可能性 (圖4d)。圖4e，f分別為IHC檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)circGFP或circPOK的腫瘤內(nèi)CD31+內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果。如圖4g所示，與對(duì)照組相比，ILF3沉默表達(dá)的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤更??；重要的是，IHC分析顯示血管生成減少(圖4h)。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)表明circPOK可以將ILF2/3復(fù)合物結(jié)合在細(xì)胞核內(nèi)，通過改變提供增殖優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)該復(fù)合物的致癌功能，并促進(jìn)血管生成。

5.CircPOK是ILF2/3復(fù)合物的協(xié)同激活物     
      假設(shè)circPOK可能會(huì)影響ILF2/3復(fù)合物的功能，而不是它的形成。為了研究這種可能性，首先分析了ELISA中確認(rèn)的被circPOK去調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的mRNAs是否可以被ILF2/3控制(圖4d)。用shRNAs沉默MSCs中ILF2/3的表達(dá)，然后分析這些mRNAs的表達(dá)。在沒有ILF2/3的情況下，細(xì)胞因子IL6和VEGF的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，但在circPOK存在時(shí)增加(圖5a)。然后確定circPOK-ILF2/3復(fù)合物是否可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后影響這些mRNA。圖5b為與ILF2相關(guān)的幾種細(xì)胞因子和血管生成因子的mRNAs的相對(duì)表達(dá)(從表達(dá)circGFP或circPOK的MSCs中下拉)。然后，用actinomycin-D處理細(xì)胞以阻斷轉(zhuǎn)錄，并在此背景下測(cè)量mRNAs IL6和Vegf.的穩(wěn)定性。如圖5c所示，circPOK的存在治療時(shí)增加了IL6和VEGF mRNAs的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)表明circPOK可以促進(jìn)ILF2/3結(jié)合mRNAs的能力，特別是IL6和Vegf.的mRNAs，并穩(wěn)定它們的mRNAs。圖5d為ChIRP分析測(cè)定IL6、Vegf和Cxcl10啟動(dòng)子區(qū)域的內(nèi)源性circPOK的占有率的結(jié)果。結(jié)果清楚地表明ILF2/3可以結(jié)合IL6的近端啟動(dòng)子區(qū)域，并且重要的是，它們?cè)趩?dòng)子中的占有率可以被circPOK增強(qiáng)(圖5e)。圖5 f為在正常條件下或在腫瘤發(fā)生過程中Pokemon蛋白和circPOK的對(duì)立作用的示意圖(左圖)；Pokemon蛋白(腫瘤抑制因子)和circPOK(原癌基因)在間充質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)生過程中所起作用的示意圖，以及它們的相關(guān)作用機(jī)制(右圖)?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)表明circPOK可能作為ILF2/3復(fù)合物的協(xié)同激活劑，并且可以增強(qiáng)ILF2/3在介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性方面的活性。