瘧疾？不可怕，先來看看m6A甲基化演個什么角

參考文獻：
Baumgarten Sebastian., Bryant Jessica M., Sinha Ameya., Reyser Thibaud., Preiser Peter R., Dedon Peter C., Scherf Artur., (2019). Transcriptome-wide dynamics of extensive mA mRNA methylation during Plasmodium falciparum blood-stage development. Nat Microbiol, 08. IF：14.3
導語：
瘧疾奪去了許多人的生病，它的發(fā)病機理是由于惡性瘧原蟲在人體紅細胞內(nèi)的無性繁殖造成的，這個過程發(fā)生在瘧疾蟲短暫的48小時生命中，并需要精確的基因表達級聯(lián)才能完成。雖然目前已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄后水平觀察到這種反應，但是在轉(zhuǎn)錄組范圍的介導機制并不清楚。因此作者在惡性瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組中鑒定了mRNA修飾，并在血液階段發(fā)育過程中對N6-甲基腺苷（m6A）進行了全面表征。該研究展示了瘧疾寄生蟲中廣泛的m6A mRNA甲基化程序的獨特特征，并揭示其在動態(tài)微調(diào)單細胞真核生物的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)中的關鍵作用。
結(jié)果分析：
1、鑒定惡性瘧原蟲在blood-stage階段的動態(tài)m6A甲基化程序
圖示惡性瘧原蟲在人紅細胞內(nèi)的無性繁殖周期，包括紅細胞侵入、宿主細胞重構(gòu)、分裂復制和紅細胞排出（圖1a）。在分析紅細胞內(nèi)的發(fā)展周期（IDC）中鑒定出10個在mRNA的修飾（圖1b，c，d）。雖然m6A甲基化的程度總體都很高，但是在瘧原蟲中更高（圖1e）。
惡性瘧原蟲基因組編碼m6A mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的高度保守（圖2a），這個保守去編碼的蛋白命名為PfMT-A70，構(gòu)建了包含HA標簽的PfMT-A70蛋白表達細胞系（圖1b）。對PfMT-A70-HA進行免疫沉淀，然后進行LC-MS，鑒定出16種特異性蛋白（圖2c，d）。三種惡性瘧原蟲的轉(zhuǎn)錄水平都在12和24h.p.i時達到高峰，比m6A/A比率最高時早一點（圖1e，2e）。

                                           圖1惡性瘧原蟲紅細胞內(nèi)部（IDC）發(fā)mRNA修飾全局動態(tài)

                                            圖2 惡性瘧原蟲m6A書寫復合體的特征
2、PfMT-A70的CRISPR干擾降低了整體m6A mRNA甲基化
對于PfMT-A70的CRISPRi，我們將其啟動子定位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游和翻譯起始位點上游~100bp，gRNA與非模板鏈互補，非特異性的gRNA表達細胞系作為陰性對照（圖3a）。gPfMT-A70靶向dCas9染色質(zhì)免疫沉淀，然后測序（ChIPseq）在靶點顯示出強大且高度特異性的富集，其與富含H3K9ac5和H2A.Z33的核小體缺失區(qū)域（FAIRE）重疊（即標志惡性瘧原蟲啟動子區(qū)域；圖3b，c）。RT-qPCR表明整個IDC中PfMT-A70轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，在12h.p.i時敲低水平為~15％，在24和36h.p.i時達到40％ （圖3d，頂部）。 雖然PfMT-A70 CRISPRi對寄生蟲生長沒有明顯的影響，但LC-MS / MS顯示在所有三個時間點m6A / A整體水平顯著下降10-30％（圖3d， 底部），進一步確定PfMT-A70是惡性瘧原蟲m6A書寫復合體的組成部分。

                                                圖3通過CRISPRi敲低PfMT-A70 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶
3、在IDC期間，mRNA轉(zhuǎn)錄物差異地m6A-甲基化
作者使用m6A-甲基化mRNA免疫沉淀（IP）和m6A-seq測定了IDC的轉(zhuǎn)錄物特異性水平上m6A mRNA甲基化的動態(tài)。 m6A-IP及LC-MS / MS顯示抗體特異性高（圖4a）。與后生動物和植物中m6A位點的拓撲結(jié)構(gòu)相反，惡性瘧原蟲中的m6A峰不會在終止密碼子和3'UTR附近富集，而表現(xiàn)出向5'末端定位的趨勢（圖4b，c）。作者搜索了與m6A峰相關的序列，發(fā)現(xiàn)GGACA基序最顯著富集，該基序類似于在酵母和人m6A位點處鑒定的RGAC和DRACH（D = G / A / U，R = G / A，H = C / A / U）基序（圖4d）。GAC基序集中在m6A峰頂周圍的±20nt區(qū)域（圖4e），表明特定m6A甲基化的某些背景依賴性。
在整個IDC中，具有至少一個m6A峰的轉(zhuǎn)錄基因總數(shù)略有增加（圖4f）。 然而，m6A富集（即m6A-IP / m6A-輸入），或來自含有特定m6A峰的一個基因的轉(zhuǎn)錄物的部分，在整個IDC中發(fā)生了廣泛的變化（圖4g）。 大多數(shù)m6A峰僅在一個時間點達到最大m6A富集，表明轉(zhuǎn)錄特異性甲基化確實是一種主動調(diào)節(jié)機制。

                                               圖4 惡性瘧原蟲IDC期間的差異m6A甲基化

4、m6A與mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率成反比關系
為了確定m6A對個體轉(zhuǎn)錄本的影響，首先比較gControl和gPfMT-A70寄生蟲之間各個m6A峰的m6A富集，并發(fā)現(xiàn)gPfMT-A70細胞系中所有時間點的富集都顯著減少（圖5a，b，頂部）。通過LC-MS / MS測量的gPfMTA70寄生蟲中全局m6A / A水平的降低來反映。（圖3d，底部）。 gControl和gPfMT-A70在每個時間點顯示高度相關性（圖5b，底部）。

                                             圖5 PfMT-A70基因敲除導致m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)

m6A-甲基化轉(zhuǎn)錄物具有比非甲基化轉(zhuǎn)錄物顯著更低的mRNA穩(wěn)定性（圖6a，左）。 這些差異在12和24h.p.i顯著，但在36h.p.i時不顯著。在12和24h.p.i時，‘m6A敏感’轉(zhuǎn)錄物的mRNA穩(wěn)定性甚至更低（m6A富集減少兩倍，轉(zhuǎn)錄本豐度增加（圖6a，右）。比較整個IDC中m6A-甲基化和非甲基化轉(zhuǎn)錄物之間的翻譯效率（TE）。在每個發(fā)育階段，m6A甲基化與轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率顯著降低相關（圖6b，左）。這種相關性在12和24h.p.i時最為明顯，但在36h.p.i時仍然顯著。 與mRNA穩(wěn)定性所見的模式類似，在12和24h.p.i時m6A甲基化和‘m6A敏感’轉(zhuǎn)錄物子集之間的翻譯效率的顯著降低（圖6b，右）。

5、惡性瘧原蟲編碼進化上保守的，多樣化的m6A結(jié)合蛋白
惡性瘧原蟲基因組編碼含有YTH結(jié)構(gòu)域的兩種不同蛋白質(zhì)：PfYTH.1（PF3D7_1419900，此前注釋為‘切割和多聚腺苷酸化特異性因子亞基4’，CPSF4）和PfYTH.2（PF3D7_0309800，圖6c）。PfYTH.2與其他已知m6A讀取蛋白的沒有總體相似性。兩種蛋白質(zhì)在IDC早期高度表達（圖6d），并且PfYTH.1的異位表達揭示了蛋白質(zhì)在細胞核和細胞質(zhì)中的定位（圖6e）。與IDC期間的動態(tài)表達相比，PfYTH.2在寄生蟲的傳播階段表現(xiàn)出甚至更高的表達，即配子體和唾液腺子孢子，后者也高度表達PfMT-A70（圖6d）。

                                              圖6 m6A與mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率的關系

結(jié)語：
該研究揭示了惡性瘧原蟲中基因表達的另一層動態(tài)和廣泛的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。 m6A mRNA甲基化的核心特征的保守性使惡性瘧原蟲成為研究m6A甲基化和基因轉(zhuǎn)錄之間相互作用的優(yōu)良系統(tǒng)。此外，該研究將m6A作為瘧疾寄生蟲“上皮轉(zhuǎn)錄組”代碼的主要參與者并為瘧疾寄生蟲的藥物的發(fā)展開辟了新的途徑。