MPNST是一種預后較差的惡性腫瘤(5年生存率<50%),是1型神經(jīng)纖維瘤病患者死亡增加的主要原因。手術切除神經(jīng)纖維瘤是MPNST的主要治療方法。對于無法切除或轉移的疾病,化療藥物的療效甚微。然而,目前還沒有有效的系統(tǒng)治療MPNST患者的方法。Ras信號通路在MPNST患者中普遍失調。眾所周知, Gal-1是穩(wěn)定膜Ras的關鍵,從而誘導Ras的活化。然而,Gal-1在MPNST進展中的作用尚不清楚。
今天小編帶大家了解近期發(fā)表的關于Gal-1抑制誘導MPNST細胞凋亡的文章Galectin-1 inhibition induces cell apoptosis through dual suppression of CXCR4 and Ras pathways in human malignant peripheral nerve sheath tumors。
本研究采用細胞存活率、凋亡測定和菌落形成等方法,觀察抑制Gal-1在MPNST細胞中的作用,以及使用人類MPNST異種移植模型來評估Gal-1抑制劑LLS2的生長和轉移抑制作用。發(fā)現(xiàn)Gal-1的上調在MPNST的CXCR4和RAS/ERK通路中起著至關重要的作用。siRNA敲除Gal-1或LLS2處理能有效誘導MPNST細胞凋亡,抑制MPNST細胞系的生長。鑒于這些結果,我們認為Gal-1是治療MPNST的良好靶點,LLS2是開發(fā)新的MPNST治療方法的良好先導化合物。
結果:
1)Gal-1在MPNST中的表達
鑒于Ras是一種眾所周知的致癌因子,且Ras活性受Gal-1調控,我們預測Gal-1是MPNST的治療靶點。我們首先從Henderson和Nakayama的Oncomine數(shù)據(jù)集中檢測了人類NF1的LGALS1轉錄水平,發(fā)現(xiàn)LGALS1在神經(jīng)纖維瘤和MPNST中顯著升高(圖1A)。我們已經(jīng)知道,NF1的缺失與NF1患者RAS/MAPK信號的激活有關。有報道稱,在NF1患者中,CXCR4過表達。正如所料,在這兩個數(shù)據(jù)集中,在NF1患者上,NF1表達下調,CXCR4表達上調。此外,還檢測了人正常神經(jīng)組織、神經(jīng)纖維瘤和MPNST中Gal-1蛋白的表達水平。MPNST組Gal-1表達水平明顯高于正常神經(jīng)組織和神經(jīng)纖維瘤(圖1B)。
2)MPNST細胞中Gal-1消耗的影響
選擇內(nèi)源性Gal-1表達的NF96.2(NF1-/-)和NF02.2(NF1+/+)MPNST細胞系,進一步闡明Gal-1在MPNST中的功能(圖2A,B)。用siRNA轉染NF96.2和NF2.2 MPNST細胞,轉染Gal-1后,如預期一樣,western blot檢測發(fā)現(xiàn)Gal-1表達降低(圖2B)。此外,敲除Gal-1能夠抑制細胞生長(圖2C),誘導凋亡膜泡化(圖2D)和半胱天冬酶活性(圖2E)。這些結果表明,Gal-1的下調可降低MPNST細胞的活力,誘導細胞凋亡。
3)Gal-1基因敲除在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性
接下來我們評估了Gal-1基因下調對MPNST腫瘤生長的影響。在體內(nèi)試驗之前,我們進行了菌落形成試驗。這種不依賴錨定的生長試驗被認為是體內(nèi)活性的一個很好的預測因子。轉染靶向Gal-1的shRNA質粒后,Gal-1表達穩(wěn)定。使用shGal-1質粒敲除Gal-1也會損害NF1 / NF96.2細胞生長(圖3A)。NF96.2細胞在2周后形成菌落(圖3B)。NF96.2細胞中Gal-1表達下調對菌落形成有明顯的抑制作用。為了研究Gal-1介導的體內(nèi)致瘤性,我們將表達對照shRNA或shGal-1的NF96.2熒光素酶標記細胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。體內(nèi)致瘤研究表明,Gal-1敲除顯著抑制裸鼠腫瘤生長(圖3C,D)。實驗結束時,切除異種移植體并稱重,以確認體內(nèi)生物熒光成像結果(圖3E)。這一發(fā)現(xiàn)表明Gal-1在MPNST的發(fā)生發(fā)展中具有致癌作用。
4)Ras信號被Gal-1的下調所抑制
RAS通路在MPNST中經(jīng)常被激活??紤]到Gal-1對穩(wěn)定膜Ras至關重要,從而誘導Ras的活化,我們研究了Gal-1的下調是否會影響Ras信號通路。我們使用了一個Ras下拉激活實驗來測定活化的Ras水平。我們還評估了CXCR4、磷酸化MEK和磷酸化ERK的表達水平,這些都是癌癥的重要治療靶點。shRNA敲除Gal-1可顯著降低活性Ras基因、CXCR4的表達以及MEK和ERK磷酸化的減少(圖4B-4D)。進一步證實Gal-1下調是否通過下調Ras和CXCR4抑制MPNST細胞增殖,誘導細胞凋亡,將pcDNA-H-Ras(G12V)或pcDNA-CXCR4載體與shGal-1質粒共轉染至NF96.2或NF2.2細胞(圖4B,4C)?;謴虷-Ras(G12V)或CXCR4可抑制Gal-1 shRNA轉染細胞的凋亡和細胞死亡(圖4E,4F)??傊?,這些數(shù)據(jù)強烈表明,Gal-1的下調導致CXCR4和Ras/ERK通路的抑制,從而抑制癌細胞的增殖。
5)LLS2對MPNST細胞中Gal-1的藥理抑制作用
Gal-1特異性siRNA對MPNST細胞生長抑制作用強,提示Gal-1是治療NF1的理想靶點。LLS2是一種新型的小分子Gal-1抑制劑,通過篩選單粒雙化合物組合文庫鑒定。在實驗中,測試了LLS2是否對MPNST細胞有類似的抗腫瘤作用。發(fā)現(xiàn)LLS2確實對NF96.2和NF2.2細胞具有毒性(圖5A)。此外,還發(fā)現(xiàn)LLS2能夠誘導這些MPNST細胞的凋亡并抑制菌落形成(圖5B,5C)。用25μM LLS2處理24h后,Ras活性、CXCR4、MEK磷酸化和ERK磷酸化減少(圖5D,5E)。
6)LLS2在NF1-/- NF96.2異種移植模型中具有抗腫瘤活性
為了進一步評估了LLS2對MPNST腫瘤生長的影響。我們通過皮下注射將NF96.2細胞植入裸鼠體內(nèi)。實驗結束時切除腫瘤并稱重。發(fā)現(xiàn)LLS2顯著降低了NF96.2腫瘤的生長(圖6A-6C)。接下來,為了考慮MPNST的侵襲性,我們建立了肺轉移模型來評估LLS2的轉移抑制作用。研究表明,12周時,LLS2處理小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤的跡象,而在對照組小鼠中觀察到明顯的腫瘤負荷(圖6D)。這些研究證明了LLS2在體內(nèi)抑制原發(fā)腫瘤生長和轉移的治療效果。