Tip 60是如何來操控BMAL 1乙?；哪?？

 乙?；褪菍⒂袡C化合物分子中的氮、氧、碳原子上引入乙?；鵆H3CO-的反應(yīng)，最常見的是組蛋白乙酰化。常用氯乙酰和Acetic Anhydride等作為乙?；瘎?。
該研究于今年8月份，德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所在《Elife》雜志上發(fā)表，題為“Acetylation of BMAL1 by TIP 60 controls BRD4-P-TEFb recruitment to circadian promoters”。揭示了Tip 60對BMAL 1乙酰化的控制機制，并為Tip 60作為乙?；磻?yīng)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

摘要：
許多生理過程都表現(xiàn)出由相互連接的激活和抑制元素組成的細(xì)胞時鐘驅(qū)動的晝夜節(jié)律。為了研究這種分子振蕩器的調(diào)節(jié)時間，我們結(jié)合了小鼠遺傳方法和關(guān)鍵晝夜節(jié)律蛋白相互作用和時鐘基因啟動子的相互作用分析。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子BRD4-PTEFb富集到含有E-box的晝夜節(jié)律啟動子。 在晝夜周期的激活階段期間，賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP 60使轉(zhuǎn)錄激活因子BMAL1乙?；瑢?dǎo)致BRD4和P-TEFb暫停釋放因子的富集，隨后是晝夜節(jié)律的生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄延伸。 我們提出BRD4-P-TEFb富集的啟動子是生物鐘周期中新的時間檢查點。

結(jié)果：
一、抑制CDK 9和BRD4消除了晝夜或者生理節(jié)律的振蕩
穩(wěn)定表達(dá)時鐘驅(qū)動的熒光素酶報告基因Bmal1-LUC的同步成纖維細(xì)胞在26小時內(nèi)持續(xù)表達(dá)。存在P-TEFb的CDK9亞基有效抑制劑flavopiridol(FP)的情況下，熒光素酶活性節(jié)律在高劑量時，節(jié)律完全喪失(圖1A)。生物鐘基因調(diào)控不僅發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始，還發(fā)生在Pol II暫停釋放和生產(chǎn)延伸的水平。用JQ1(選擇性BRD4抑制劑)處理Bmal1-LUC報告基因成纖維細(xì)胞以劑量依賴性方式抑制熒光素酶活性節(jié)律，引起周期延長(圖1B)，還導(dǎo)致這些細(xì)胞中內(nèi)源性Dbp表達(dá)節(jié)律的強烈抑制(圖1C)。在JQ1存在下，Dbp的轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上BRD4和CDK9的富集顯著減少(圖1D)。在Dbp的3'末端，Pol II的Ser2磷酸化被強烈減少(圖1E)，表明Pol II暫停釋放已被抑制。降低的Dbp表達(dá)可能是由于BMAL1水平較低。我們的JQ1抑制劑研究表明BRD4-P-TEFb被富集到含有E-box的時鐘控制基因Dbp中，隨后允許Pol II暫停釋放和轉(zhuǎn)錄延伸。因此，對于這種生物鐘控制的基因，Pol II暫停釋放可以作為其轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)步驟。

                                              圖1.BRD 4控制時鐘基因的表達(dá)。


二、需要在賴氨酸538處乙?；疊MAL1以啟動晝夜節(jié)律的生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄延伸
BRD4在暫停基因的啟動子上與轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白的乙?；嚢彼峤Y(jié)合。觀察到JQ1對細(xì)胞晝夜節(jié)律的強烈影響，提出了在BRD4靶標(biāo)中存在核心時鐘組分的可能性，例如BMAL1，其在Lys538處被乙?；商峁〣RD4的結(jié)合位點。作者采用免疫沉淀實驗研究了含有工程化BMAL1^K538R的對照成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中檢查BRD4和CDK9與BMAL1的相互作用，結(jié)果表明在表達(dá)BMAL1^K538R的細(xì)胞中，這種相互作用顯著降低(圖2A)。當(dāng)野生型細(xì)胞經(jīng)JQ1處理時，這種相互作用基本上受到抑制。 ChIP實驗證明BMAL1^K538R突變細(xì)胞顯示BRD4和P-TEFb亞基CDK9向Dbp(圖2B)的TSS的富集減少。 此外，Ser2-磷酸化的Pol II的富集顯著降低(圖2B)。由于對照成纖維細(xì)胞和BMAL1^K538R突變細(xì)胞均穩(wěn)定表達(dá)時鐘驅(qū)動的熒光素酶報告基因，我們評估了K538R突變對發(fā)光節(jié)律的影響。在BMAL1^K538R細(xì)胞中，幾乎沒有記錄三個克隆中任何一個的節(jié)律性熒光素酶報告基因表達(dá)(圖2C)。另外，在這些細(xì)胞中，內(nèi)源性Dbp(圖2D) mRNA的峰表達(dá)顯著降低。BMAL1乙?；赡芰硗獯龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄起始，利于轉(zhuǎn)錄延伸而非起始是主要通過BMAL1的乙?；{(diào)節(jié)的過程。因此，乙?；腂MAL1將BRD4-P和TEFb富集到含有E-box的生物鐘基因，然后導(dǎo)致Pol II從其暫停狀態(tài)釋放，從而允許生產(chǎn)性延長。

                                            圖2.BMAL 1的Lys 538乙?；瘜D(zhuǎn)錄延伸至關(guān)重要。

三、TIP 60對于小鼠生物鐘的功能是必不可少的。  
BMAL1乙?；蒀LOCK進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)在CLOCK缺陷的成纖維細(xì)胞中，BMAL1在Lys538處被乙酰化與野生型細(xì)胞中觀察到的相似程度(圖3A)。 CLOCK^mutA不能使組蛋白H3和H4乙?；?，并且BMAL1的乙?；钚源蟠蠼档?。與對照相比，兩種CLOCK變體呈現(xiàn)出BMAL1乙?；淖钚≡黾?圖3B)，存在CLOCK或CLOCK^mutA時BMAL1乙?；诫y以區(qū)分?？傊@些數(shù)據(jù)表明存在催化BMAL1乙?；奶娲阴＾D(zhuǎn)移酶TIP 60，其與CLOCK-BMAL1共同純化并且乙?；瘡V泛的轉(zhuǎn)錄因子。添加TIP 60，但不是酶促失活的TIP 60^{C369A; E403Q}，強烈增強了BMAL1乙?；?圖3B)。

                                          圖3.BMAL 1在缺乏時鐘的細(xì)胞中的乙?；?br/>這種生物鐘新潛在調(diào)節(jié)器促使我們產(chǎn)生條件性Tip 60小鼠，以評估該酶的體內(nèi)功能并用于體外研究分子鐘的成纖維細(xì)胞。Tip 60^fl/- 攜帶Tip 60的一個條件和一個缺失等位基因的小鼠(圖4)與Syt10-CRE驅(qū)動小鼠交配。該驅(qū)動因子在SCN的有絲分裂后神經(jīng)元中具有強烈活性，可以規(guī)避與TIP 60缺陷相關(guān)的細(xì)胞致死率。所有后代攜帶兩個拷貝的敲入Cre等位基因(Syt10Cre/Cre Tip 60^{fl /-} )和一半攜帶一個拷貝的敲入Cre等位基因(Syt10Cre/+ Tip 60 ^fl/- )的小鼠在釋放后立即變得心律失常。恒定暗度(DD)(圖4A和B)，Syt10Cre ^/+ Tip 60 ^fl/-小鼠的其余部分顯示更長(29％)或正常(21％)自由運行期。SCN中TIP 60的免疫組織化學(xué)染色顯示核信號，其在心律失常的Syt10Cre ^{/ +} Tip 60 ^fl/- 小鼠中不存在(圖4C)。晝夜節(jié)律SCN中Per1，Dbp和Bmal1的表達(dá)模式受到嚴(yán)重抑制(圖4D)，與這些動物中觀察到的行為心律失常一致。細(xì)胞融合足以誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止，從而繞過TIP 60在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用。除管家基因之外，缺失導(dǎo)致熒光素酶報告基因的節(jié)律表達(dá)的顯著抑制和內(nèi)源性時鐘基因的顯著降低的表達(dá)(圖4E和4F)。因此，刪除TIP 60功能對SCN體內(nèi)和有絲分裂后MEF中的運動活性和時鐘基因的節(jié)律性表達(dá)具有重要影響。

                                      圖4.Tip 60-缺乏引起小鼠晝夜節(jié)律表型，并干擾SCN和MEFs中節(jié)律時鐘基因的表達(dá)。


四 、Tip 60乙?；?/strong>BMAL 1在賴氨酸538
小鼠嚴(yán)重的晝夜節(jié)律表型、Tip 60缺陷SCN和MEFs中時鐘基因表達(dá)的強烈變化以及共轉(zhuǎn)染實驗(圖3B)均表明BMAL1可能是Tip 60的直接基板。共轉(zhuǎn)染實驗顯示bmal 1的Lys 538以劑量依賴性的方式被Tip 60乙?；?，而缺乏乙酰轉(zhuǎn)移酶的Tip 60^{c369a；e403q}導(dǎo)致類似模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BMAL 1基線乙?；?圖3B；圖5A)。Lys 538似乎是Tip 60作為信號乙?；闹饕嚢彼?。 在BMAL1^K538R和Tip 60共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，抗PAC-ack抗體明顯減少(圖5A)。Tip 60與野生型和BMAL1K538R共沉淀，表明兩者之間存在相互作用這兩種蛋白質(zhì)(圖5A)。BMAL 1的乙?；饔貌挥绊戇@種相互作用。重組TIP 60GST乙?；亟MBMAL1GST在Lys 538(圖5B)，在Tip 60缺陷MEFs中，內(nèi)源性BMAL 1的Lys 538乙?；黠@減少(圖5C)。 當(dāng)內(nèi)源性Tip 60被Bmal1-Luc報告細(xì)胞中的TIP 60^{C369A；E403Q}替代時，內(nèi)源性DBP的熒光素酶節(jié)律和mRNA節(jié)律被阻斷(圖5D和E)?？傊?，這些 數(shù)據(jù)提供強有力的證據(jù)表明BMAL1是TIP 60的底物。

                                                      圖5.Tip 60乙酰化BMAL 1。

五、Tip 60控制晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生延長
使用BRD 4和P-TEFb(圖2A和B)。此外，在BMAL1^K538R細(xì)胞中，PolⅡSer2磷酸化(一種生產(chǎn)延長率的指標(biāo))明顯降低(圖2B)。因此，刪除Tip 60應(yīng)該廢除BRD4-P-TEFb富集和POL II暫停發(fā)布。事實上，在融合的Tip 60缺陷的Dex同步纖維瘤中 TS，BMAL 1是低乙?；?圖5C和6A)，BMAL 1和BRD 4(圖6A和B)以及BMAL 1和CDK 9(圖6C)之間的相互作用嚴(yán)重喪失。芯片實驗顯示 在DBP、PER 1和Nr1d1基因的tss上，BRD 4和CDK 9的富集量明顯減少，而Ser2磷酸化的POLⅡ占用率降低(圖6D)。
以上數(shù)據(jù)表明，BMAL 1的乙?；谵D(zhuǎn)錄延伸中起著關(guān)鍵作用。Tip 60乙?；疊MAL 1，Tip 60缺失不應(yīng)該影響轉(zhuǎn)錄起始。刪除TIP 60不影響TIFIEA富集到DBP、Per1和NR1D1基因的TSS。

                                                     圖6. TIP 60控制生產(chǎn)延長率。
六 、晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生延長的節(jié)律性
我們的實驗證明TIP 60介導(dǎo)的BMAL1的乙?；巧镧娬袷幤鞯年栃灾w的必要元素。 TIP 60介導(dǎo)的BMAL1乙?；瘜?dǎo)致BRD4和暫停釋放因子P-TEFb富集至?xí)r鐘基因TSS。反而允許CLOCK-BMAL1控制基因的生產(chǎn)性延長。在E-box控制的時鐘基因的啟動子的暫停釋放因子的時間占有情況中也應(yīng)該看到正晝夜調(diào)節(jié)的正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)之間的平衡。在細(xì)胞同步后大約24小時，我們觀察到在Dbp，Per1和Nr1d1基因的啟動子處BMAL1和乙?；疊MAL1的最強富集(圖7A)。核提取物中乙酰化BMAL1的濃度在此時呈現(xiàn)最大值(圖7B)。BRD4的占據(jù)在靶基因啟動子處達(dá)到峰值(圖7A)，并且Pol II的Ser2磷酸化顯示最大值(圖7A)。因此，Dbp，Per1和Nr1d1 mRNA的豐度在24和28小時之間達(dá)到峰值(圖7A)?？傊覀兊臄?shù)據(jù)顯示依賴于TIP 60的BRD4富集，Pol II暫停釋放和生產(chǎn)延長在晝夜周期中精確定時，并且以這種方式對生物鐘振蕩器施加時間控制。

                                                          圖7.生產(chǎn)延長的有節(jié)奏的輪廓。

結(jié)論：
暫停釋放涉及到由Tip 60介導(dǎo)的BMAL 1的Lys 538的染色質(zhì)乙?；磻?yīng)，Bmal1乙?；试S向AcBMAL 1富集輔助激活劑BRD 4。BRD 4依次富集暫停釋放因子P -TEFb，其激酶亞基CDK 9然后磷酸化POLⅡ的Ser2，導(dǎo)致POLⅡ從停頓狀態(tài)釋放，從而使含有E-box的晝夜節(jié)律基因得以產(chǎn)生延長。