自然殺傷細胞對肺腺癌適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用

近日，麻省理工學院在PNAS上發(fā)表了一篇題名為：通過自然殺傷細胞刺激增強肺腺癌的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的文章。該研究設(shè)計了一種用于在腫瘤中誘導(dǎo)表達活化配體的系統(tǒng)。刺激后，自然殺傷（NK）細胞定位于腫瘤內(nèi)部，細胞因子產(chǎn)生能力增強。T細胞也以NK細胞依賴性方式聚集到腫瘤中，并表現(xiàn)出更高的功能性。在表達新抗原的腫瘤中，NK細胞刺激增強了腫瘤特異性T細胞的數(shù)量和功能，并且在長期環(huán)境中減少了腫瘤生長。NK細胞也可以被激活以促進抗腫瘤免疫，從而支持它們作為癌癥免疫療法中的重要靶標的潛力。

1.NK細胞在LUAD小鼠模型中表現(xiàn)為不成熟表型和低功能性
為了研究NK細胞和肺腫瘤之間的相互作用，使用了由Cre重組酶誘導(dǎo)的致癌Kras G12D激活和腫瘤抑制因子p53 缺失驅(qū)動的LUAD 小鼠模型。用Lenti-Cre氣管內(nèi)感染KP小鼠，引發(fā)腫瘤形成。通過流式細胞術(shù)，觀察到與健康肺相比，在攜帶腫瘤的肺中具有NK細胞特征性標志物（NK1.1 +; CD8-; CD4-或NK1.1 +; CD3-）的細胞數(shù)量增加，而健康肺組織隔室中很少有NK樣細胞。這些標記物不能區(qū)分cNK細胞和ILC1亞型;進一步的免疫表型分析顯示，根據(jù)DX5（CD49b）染色，該群體可細分為2組，并且這些DX5 +和DX5-亞群可在健康和攜帶腫瘤的肺組織中發(fā)現(xiàn)。還觀察到Ly49H NK細胞激活受體的表達局限于G1-ILC中的DX5 +組，表明這是在肺中cNK細胞上特異性表達的標志物。使用抗Nkp46抗體對腫瘤切片進行IHC染色顯示G1-ILC位于腫瘤周圍的基質(zhì)中，而不是腫瘤內(nèi)。流式細胞儀分析顯示，與血液和脾臟來源的細胞相比，肺組織中具有更多未成熟cNK細胞的表面標志物表型（CD11blow; CD27high; KLRG1low）特征。與血液來源的細胞相比，組織G1-ILC顯示出低的細胞因子產(chǎn)生能力。由于從攜帶腫瘤的肺中分離出有限的細胞，無法進行細胞毒性測定。然而，觀察到組織來源的G1-ILC上的CD107a表達水平高于血液來源的細胞。盡管仍有待確定該表型是否與該群體中的細胞毒性功能相關(guān)。有趣的是，在健康和攜帶腫瘤的肺部分離的細胞之間看到了相似的表面表型和功能能力，這表明這些是肺組織隔室中NK樣細胞與血液相比具有一般特征?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，盡管它們富集KP肺腫瘤，G1-ILC表現(xiàn)出低功能性，類似于人LUAD中的NK細胞，提出了NK細胞功能是否可以在確定疾病的情況下用于治療干預(yù)。

2.NK細胞應(yīng)答可以在既定腫瘤中增強。
在肺上皮特異性細胞分泌蛋白（Ccsp）啟動子（KP rtTA）的控制下，進入KP模型，進入反向四環(huán)素反式激活因子（rtTA）轉(zhuǎn)基因，從而可以在肺腫瘤中特異性誘導(dǎo)NK細胞配體的表達。為了研究是否可以在確定的KP肺癌中刺激NK細胞反應(yīng)，使用Lenti-TREm157（或Lenti-TREnegm157）啟動腫瘤，允許它們生長10至14周，然后將小鼠置于含有Dox的飲食中誘導(dǎo)M157表達。配體誘導(dǎo)一周后，與對照組相比，觀察到腫瘤攜帶肺組織中總G1-ILC數(shù)量增加和m157特異性（Ly49H +）NK細胞富集。Ly49H + NK細胞在配體后第2天表現(xiàn)出增增加。有趣的是，在相同的動物中觀察到Ly49H-G1-ILC的后來（第6天）Ly49H非依賴性增殖期，可能是由于Ly49H + NK細胞刺激產(chǎn)生的促炎信號。觀察到m157誘導(dǎo)后Ly49H + NK細胞上Ly49H的表面水平降低，這是通過該途徑發(fā)出信號的特征。在離體刺激測定中，與對照相組比，G1-ILC在腫瘤中m157誘導(dǎo)后表現(xiàn)出更高的細胞因子產(chǎn)生能力。m157誘導(dǎo)也導(dǎo)致NKp46 +細胞的瘤內(nèi)定位增加，相比之下，這些細胞在對照腫瘤中更嚴格的基質(zhì)存在。這些發(fā)現(xiàn)表明NK細胞的細胞因子產(chǎn)生能力可以通過cNK細胞特異性識別的活化進行增強。

3.刺激的NK細胞將適應(yīng)性免疫細胞募集到腫瘤中。
接下來，想探討NK細胞刺激對該模型中適應(yīng)性免疫的影響。使用流式細胞術(shù)，組織學和IHC組合分析，觀察到T細胞和B細胞強烈募集到誘導(dǎo)表達m157的腫瘤。攜帶腫瘤的肺組織中T和B淋巴細胞數(shù)量的增加依賴于NK1.1 +細胞，這種效應(yīng)因其消耗而被消除，表明T細胞和B細胞的募集不僅僅是由于針對自身的適應(yīng)性反應(yīng)。此外， negm157突變體的表達，與m157僅相差3個氨基酸，不會導(dǎo)致T或B細胞的募集。與對照相比，來自表達m157的腫瘤的肺組織T細胞響應(yīng)于離體刺激表現(xiàn)出更高的細胞因子產(chǎn)生能力。雖然CD44 +和CD44-T細胞都被募集到腫瘤中，但m157誘導(dǎo)促進了抗原，CD44 + CD4 +和CD8 + T細胞的增殖。這些結(jié)果表明在已建立的肺腫瘤中刺激NK細胞應(yīng)答導(dǎo)致適應(yīng)性免疫細胞的募集和增強的T細胞功能。

4.CCL5（RANTES）在淋巴細胞向腫瘤的募集中發(fā)揮作用
為了研究在系統(tǒng)中向T細胞募集T細胞所涉及的因素，從來自KP rtTA或KP rtTA; Ly49H缺陷的腫瘤肺中制備裂解物。小鼠在配體后第0,2和6天誘導(dǎo)并使用細胞因子和趨化因子陣列分析它們。盡管不能排除IFN-γ在m157誘導(dǎo)的反應(yīng)中的作用，但陣列分析并未發(fā)現(xiàn)該細胞因子的顯著富集。確實發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL5和細胞因子IL-12顯著增加。通過流式細胞術(shù)分析觀察到m157誘導(dǎo)后CCL5 + G1-ILC的比例增加，表明NK細胞可能是這種情況下CCL5的來源。為了直接測試CCL5的作用，使用中和抗體在m157誘導(dǎo)前阻斷其功能。 CCL5阻斷消除了CD8 + T細胞向腫瘤的募集。還觀察到腫瘤中G1-ILC和CD4 + T細胞數(shù)量減少的趨勢，盡管這沒有達到統(tǒng)計學顯著性。來自配體表達腫瘤的T細胞在離體刺激測定中顯示出CCL5阻斷的細胞因子產(chǎn)生能力降低，但重要的是，沒有區(qū)分CCL5是否直接影響T細胞應(yīng)答或僅僅是招募功能不同的T細胞亞群，或兩者兼而有之。G1-ILC的細胞因子產(chǎn)生沒有顯著影響，表明它們的功能不依賴于CCL5。這些結(jié)果表明CCL5在NK細胞依賴性募集CD8 + T細胞至腫瘤中起作用。

5.刺激的NK細胞反應(yīng)是短暫的，可以通過IL-15加強
為了研究NK細胞刺激對抗腫瘤反應(yīng)的長期影響，檢查了淋巴細胞數(shù)量和功能。3周后，G1-ILC的數(shù)量和細胞因子產(chǎn)生能力不再比對照增加。這些結(jié)果表明，盡管NK細胞仍然對已建立的腫瘤中的刺激具有反應(yīng)性，但它們的反應(yīng)是短暫的，可能是由于TME中存在免疫抑制因子或僅僅是誘導(dǎo)NK細胞低反應(yīng)性的內(nèi)在負反饋機制。在配體誘導(dǎo)3周后，T細胞數(shù)和細胞因子產(chǎn)生能力也不再高于對照組。
在治療環(huán)境中，NK細胞反應(yīng)的短暫性質(zhì)可能對組合治療的合理時機具有重要意義。例如，可能存在有限的時間窗口，在此期間NK細胞靶向治療可以增強由T細胞靶向療法實現(xiàn)的抗腫瘤免疫。值得注意的是，觀察到氣管內(nèi)給予IL-15（一種已知可刺激NK細胞活化的細胞因子）均可增強G1-ILC反應(yīng)，類似于對照腫瘤中的配體誘導(dǎo)，并在長期配體表達后挽救了G1-ILC反應(yīng)下降，細胞數(shù)，術(shù)語Ly49H + G1-ILC和CCL5染色，以及細胞因子產(chǎn)生，表明用于啟動或延長NK細胞應(yīng)答窗口的治療途徑。重要的是，雖然IL-15給藥在持續(xù)m157刺激后增加了Ly49H +細胞的比例，但它可能作用于所有G1-ILC群體，以及T細胞和其他亞群，與先前的刺激無關(guān)。因此，無法區(qū)分IL-15是否起作用以拯救先前刺激的NK細胞，或者可能將循環(huán)NK細胞募集到攜帶腫瘤的肺組織中，或兩者兼而有之。
值得注意的是，實驗室以前的研究表明，KP模型中的腫瘤很少獲得非同義編碼突變，這表明KP腫瘤基本上沒有新抗原。因此，在缺乏強抗原的情況下，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可能無法獲得牽引力，導(dǎo)致其在NK細胞功能喪失后下降。重要的是，沒有描述在這種“非免疫原性”系統(tǒng)中招募腫瘤的T細胞的特異性，無法確定它們是否識別腫瘤抗原，或者是否他們的招募是抗原非依賴性的。

6.NK細胞刺激導(dǎo)致增強的腫瘤特異性T細胞應(yīng)答
利用LucOS / TREm157系統(tǒng)產(chǎn)生免疫原性腫瘤，然后在攜帶腫瘤的小鼠中14至16周后施用Dox以刺激NK細胞，并且在1周后收獲組織用于分析。實驗室LucOS系統(tǒng)的先前工作表明，在腫瘤開始后14至16周，抗原特異性T細胞的數(shù)量和功能已經(jīng)下降，并獲得了疲憊的表型。正如之前在非免疫原性KP肺腫瘤中所見，m157配體誘導(dǎo)也導(dǎo)致在該環(huán)境中腫瘤組織中整體CD8 + T細胞數(shù)量增加。使用SIIN-四聚體，觀察到表達配體的腫瘤也富含抗原特異性T細胞。最后，測試了NK細胞刺激是否可以增強過繼轉(zhuǎn)移的抗原特異性T細胞的反應(yīng)。從OTI TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠的脾中分離出一千萬個先天性標記的（Thy1.1 +）幼稚SIIN特異性T細胞，并在Dox施用后1天將眼窩后轉(zhuǎn)移到具有LucOS / TREm157腫瘤的動物中。十天后，觀察到轉(zhuǎn)移的OTI T細胞在NK細胞刺激后構(gòu)成比對照動物更大的CD8 + T細胞群。此外，觀察到離體刺激測定中轉(zhuǎn)移的來自NK細胞配體誘導(dǎo)的腫瘤的OTI細胞產(chǎn)生的細胞因子增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫原性腫瘤中的NK細胞刺激可以通過募集（在內(nèi)源性T細胞的情況下）或通過募集和增強功能（在過繼性T細胞治療的情況下）改善腫瘤特異性T細胞應(yīng)答，因此增強抗腫瘤免疫力。因此，用于刺激TME中的NK細胞的治療方法可以與基于T細胞的癌癥治療互補。

7.NK細胞可以增強免疫原性腫瘤的控制
為了評估NK細胞是否可以在長期環(huán)境中存在刺激信號的情況下影響肺癌進展，開始使用Dox飲食小鼠，然后在1天后使用Lenti-TREm157或Lenti-TREnegm157啟動腫瘤，并繼續(xù)使用Dox在腫瘤發(fā)展過程中進行治療直至小鼠瀕臨死亡。觀察到在攜帶腫瘤的小鼠中總體存活率僅有適度增加，所述腫瘤在腫瘤發(fā)展早期表達激活的NK細胞配體，表明單獨的NK細胞不能提供針對疾病進展的實質(zhì)性保護，即使腫瘤被迫表達刺激信號。
為了評估NK細胞刺激對該模型中免疫原性腫瘤進展的影響，開始表達具有或不具有誘導(dǎo)型m157的LucOS的腫瘤，并且在1周后施用Dox。將小鼠保持在Dox上12周，之后收集組織用于分析。引人注目的是，與攜帶OVA腫瘤的肺相比，觀察到LucOS / TREm157荷瘤肺中的腫瘤負荷顯著降低。LucOS / TREm157腫瘤的數(shù)量較少且尺寸小于LucOS腫瘤，表明免疫原性腫瘤中的NK細胞刺激導(dǎo)致消除病變并抑制確實出現(xiàn)的腫瘤生長?？傊?，這些實驗表明，無論NK細胞是否在該模型中自然地形成腫瘤進展，它們都能夠在刺激信號的存在下增強適應(yīng)性抗腫瘤免疫力。

結(jié)論:
作者認為，導(dǎo)致腫瘤中NK細胞功能增強的策略可能是T細胞募集的強大機制，除了NK細胞直接殺傷的潛在有益作用外，還可以提高T細胞治療癌癥的療效。