外泌體 miR-301a TCEAL7 Wnt/b-catenin信號(hào)通路

在'外泌體'的概念發(fā)展以前，科學(xué)家就對(duì)血清/血漿/體液中的核酸已經(jīng)有了一定的研究，當(dāng)時(shí)將這些核酸統(tǒng)稱為循環(huán)核酸(Circulatingnucleic acid)。miRNA作為循環(huán)核酸中的一種，miRNA調(diào)控基因表達(dá)，exosome是細(xì)胞外運(yùn)輸工具遞送miRNA和其他物質(zhì)到達(dá)細(xì)胞周?chē)xosome通過(guò)受體細(xì)胞吸收，釋放miRNA，是癌癥發(fā)展、遷移的潛在原因之一。miRNA與靶mRNA的結(jié)合，可導(dǎo)致miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制靶基因表達(dá)或降解，從而靶基因引起下游信號(hào)通路的變化。這是一種常見(jiàn)的研究外泌體思路。所以，循環(huán)miRNA的研究一直以來(lái)都是miRNA研究的重要方向之一。
幾乎所有人類(lèi)實(shí)體瘤都暴露于微環(huán)境因素如缺氧，缺氧通過(guò)促進(jìn)癌癥和基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)的各種變化而在腫瘤進(jìn)展和對(duì)治療的抗性中起重要作用，腫瘤缺氧是抗癌失敗的主要因素。腫瘤缺氧可以降低常規(guī)療法的有效性，例如放射療法。7月份，X Yue等人發(fā)表一篇 “Hypoxic Glioma Cell-Secreted Exosomal miR-301a Activates Wnt/b-catenin Signaling and Promotes Radiation Resistance by Targeting TCEAL7 ”的SCI文章，發(fā)表雜志為：Molecular Therapy ，這項(xiàng)研究主要發(fā)現(xiàn)了缺氧膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞釋放的外泌體 exo-miR-301a通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/b-catenin信號(hào)通路干擾放射治療的敏感性。
技術(shù)路線:

結(jié)果:
一、缺氧GBM細(xì)胞特異性表達(dá)和分泌exo-miR-301a
背景： HIF-1a作為缺氧標(biāo)志物，可以與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中miR-301a的表達(dá)進(jìn)行比較。
目的：檢測(cè)  exo-miR-301a在缺氧人GBM中的潛在功能。

 圖1. miR-301a被缺氧GBM細(xì)胞特異性表達(dá)和分泌，并通過(guò)外來(lái)體分泌轉(zhuǎn)到含氧量正常的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。（A）在高HIF-1a水平的患者中觀察到miR-301a高表達(dá)（B）exo-miR-301a與HIF-1a的表達(dá)正呈相關(guān)。（C）ELISA結(jié)果顯示GBM細(xì)胞通過(guò)增加細(xì)胞核中 HIF-1a的水平來(lái)應(yīng)對(duì)缺氧微環(huán)境變化。（D）Western印跡檢測(cè)在含氧量正常或缺氧條件下GBM細(xì)胞的外泌體標(biāo)志物CD9，CD63，CD81和HSP70，與常氧細(xì)胞相比，缺氧條件下細(xì)胞分泌的外泌體標(biāo)志物蛋白的表達(dá)水平均升高。（E）通過(guò)納米粒子追蹤分析檢測(cè)到缺氧條件下，外泌體的分泌量增多。(F,G,H) 為了研究不同條件下的 HIF-1a與miR-301a和exo-miR-301a的關(guān)系。通過(guò)缺氧和HIF-1a干擾RNA（siRNA）處理GBM細(xì)胞，缺氧條件下miR-301a和exo-miR-301a的表達(dá)顯著增加；同時(shí)，HIF-1a的下調(diào)顯著降低了miR-301a和exo-miR-301a的表達(dá)?？傊?，該文獻(xiàn)證明了exo-miR-301a是由GBM細(xì)胞缺氧下特異性分泌并且與 HIF-1a呈正有關(guān)。
二、缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞的 exo-miR-301a直接靶向常氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的 TCEAL7
背景： TCEAL7是腫瘤抑制基因。
目的：探索miR-301a在缺氧性膠質(zhì)瘤中的潛在機(jī)制，運(yùn)用軟件Targetscan預(yù)測(cè)miR-301a的靶基因，探索miR-301a調(diào)控靶基因 TCEAL7的機(jī)制。

     
檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者exo-miR-301a和TCEAL7的相關(guān)性。TCEAL與miR-301a的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
（A）miR-301a與 TCEAL7基因 3’端UTR含有兩個(gè)高度保守的靶位點(diǎn)，第一個(gè)是結(jié)合位點(diǎn)。（B）As-miR-301a或NC轉(zhuǎn)染pGL3-WT-TCEAL7-3 UTR-Luc和pGL3-MUT-TCEAL7-3 報(bào)告體。在常氧和缺氧條件下，用As-miR-301a轉(zhuǎn)染導(dǎo)致TCEAL7表達(dá)顯著降低。（C）蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)用As-miRNA-301a轉(zhuǎn)染后在常氧和缺氧條件下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TCEAL7的表達(dá)降低。（D）熒光素酶報(bào)告基因表明與對(duì)照和常氧外泌體組相比，缺氧外泌體組熒光素酶活性降低。（D）相對(duì)于常氧條件下，缺氧GEM衍生的外泌體TCEAL7的表達(dá)降低。（E）As-miR-301a阻止缺氧外泌體對(duì)TCEAL7蛋白質(zhì)下調(diào)的回復(fù)
三、在GBM惡性腫瘤中TCEAL7的表達(dá)下調(diào)
背景： 在此課題之前的研究中，在惡性膠質(zhì)瘤中b-catenin高表達(dá)

（A）免疫組織化學(xué)分析顯示TCEAL7的表達(dá)水平，并且隨著膠質(zhì)瘤惡性狀態(tài)的提高而下調(diào)。（B）qPCR檢測(cè)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的TCEAL7表達(dá)，TCEAL7在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)低于正常組織中的表達(dá)，并且隨著病理分級(jí)的升高而降低。（C）Kaplan-Meier生存曲線分析了TCEAL7高表達(dá)或低表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，高  TCEAL7表達(dá)患者的存活率顯著高于TCEAL7表達(dá)低的患者。（D）蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TCEAL7的表達(dá)水平，與空載體（EV）相比，TCEAL7載體組中TCEAL7蛋白水平顯著增加。（E）TCEAL7顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力。（F）轉(zhuǎn)染TCEAL7載體的細(xì)胞在軟瓊脂上形成的菌落顯著少于對(duì)照組。（G）TCEAL7顯著降低GBM侵襲能力。（H）TCEAL7誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡。（I）建立了皮下移植瘤模型，前9天兩組腫瘤大小無(wú)顯著差異 ;然而，從第10天開(kāi)始，與對(duì)照組相比， TCEAL7組顯示出異種移植腫瘤的大小顯著降低。
四、TCEAL7通過(guò)與b-catenin結(jié)合而影響b-catenin的穩(wěn)定性來(lái)負(fù)調(diào)控Wnt / b-catenin途徑

 (A-B): TCEAL7通過(guò)與b-catenin結(jié)合卻不抑制b-catenin（A和B）的穩(wěn)定性來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)Wnt / b-catenin途徑。首先研究TCEAL7過(guò)表達(dá)對(duì) b-catenin / T細(xì)胞因子（ TCF）轉(zhuǎn)錄活性的影響，這是由  TOP和FOP FLASH在H4細(xì)胞中進(jìn)行的。添加  b-連環(huán)蛋白顯著增強(qiáng)了TOP FLASH活性，但沒(méi)有FOP  FLASH活性。然而，TCEAL7的過(guò)表達(dá)以劑量依賴的方式抑制了 b-catenin刺激的TOP  FLASH報(bào)告基因的激活。（C）TCEAL7的敲減促進(jìn)了Wnt靶基因的表達(dá)。（D）蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TCEAL7過(guò)表達(dá)不會(huì)抑制b-catenin水平。（E）CHX追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)  TCEAL7的細(xì)胞中b-catenin沒(méi)有顯著變化。用CHX（20mg / mL）處理細(xì)胞指定的小時(shí)。（F）純化的TCEAL7和b-連環(huán)蛋白之間的相互作用。（G）免疫沉淀測(cè)定法檢查異位表達(dá)的b-catenin和TCEAL7之間的相互作用。（H）免疫沉淀測(cè)定法檢查內(nèi)源性b-catenin和TCEAL7之間的相互作用。（I）免疫熒光檢測(cè)到b-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。
五、低氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的exo-miR-301a向常氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并通過(guò)靶向TCEAL 7增強(qiáng)wnt/b-catenin信號(hào)

（A）從低氧外泌體孵育的含氧量正常的細(xì)胞中提取RNA并分析miR-301a水平。（B）從不同來(lái)源的缺氧外泌體孵育24小時(shí)（或作為對(duì)照的PBS）的含氧量正常的細(xì)胞中提取的RNA分析pri-miR-301a或pre-miR-301a的水平。（C）存在或不存在5,6-二MCB并咪唑1-bD-呋喃核糖苷（DRB）（20mM）的情況下，將缺氧分泌的外泌體喂養(yǎng)到含氧量正常的細(xì)胞中。24小時(shí)后，分析從受體細(xì)胞中提取的RNA的miR-301a水平。（D）用miR-301a模擬物，TCEAL7載體，As-miR-301a或si-TCEAL7處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且TOP / FOP測(cè)定檢測(cè)Wnt / b-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的活性。（E）用As-miR-301a或TCEAL7  siRNA處理缺氧神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且TOP / FOP測(cè)定檢測(cè)Wnt/ b-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的活性。（F）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以評(píng)估細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中b-catenin的蛋白質(zhì)水平。
六、miR-301a參與低氧外泌體共培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射增敏作用。
目的：探究缺氧exo-miR-301a是否介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射增敏作用。

（A）在 0-8Gy的劑量范圍內(nèi)暴露于輻射后檢測(cè)細(xì)胞的存活曲線。 MTT和克隆形成結(jié)果顯示,與常氧細(xì)胞相比，缺氧外泌體組呈現(xiàn)出輻射抗性并且輻射誘導(dǎo)的存活率沒(méi)有顯著降低。此外， miR-301a的下調(diào)或TCEAL7的增加顯著增加細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性（  p <0.01）。（B）與常氧外泌體組相比，缺氧外泌體組不能進(jìn)一步抑制細(xì)胞活力;轉(zhuǎn)染As-miR-301a或TCEAL7時(shí)，結(jié)果相反。（C）流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-301a對(duì)照射后細(xì)胞凋亡的影響。（D）常氧外泌體培養(yǎng)組中 4-或8-Gy照射誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分比顯著高于缺氧外泌體組，當(dāng)伴隨 As-miR-301a或TCEAL7時(shí)，細(xì)胞凋亡能力恢復(fù)。向量。為了促進(jìn)體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)使用  U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系建立皮下腫瘤以進(jìn)一步評(píng)估 miR-301a在低氧膠質(zhì)瘤的輻射抗性中的作用。在異種移植物生長(zhǎng)測(cè)定中，與對(duì)照組相比，單獨(dú)放射不能顯著降低缺氧外泌體組中的腫瘤生長(zhǎng)，并且通過(guò)體外檢測(cè)觀察到 As-miR-301a或TCEAL7載體增強(qiáng)腫瘤抑制的作用。（ E）qPCR以檢查由 Wnt / b-連環(huán)蛋白途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的mRNA水平。Wnt  / b-catenin下游基因在缺氧外泌體條件下被激活;然而，As-miR-301a或TCEAL7可顯著抑制過(guò)表達(dá)。** p<0.01。