單細(xì)胞測(cè)序鑒定免疫反應(yīng)的異質(zhì)性

世界上沒(méi)有兩片相同的樹(shù)葉，對(duì)于多細(xì)胞生物而言，其細(xì)胞與細(xì)胞之間也存在著差異，且不同群體細(xì)胞間的差異不一。這種差異不僅體現(xiàn)在形態(tài)上，也體現(xiàn)在遺傳信息上，例如基因組信息、基因表達(dá)水平等。單細(xì)胞生物學(xué)是近幾年非常熱門(mén)的話題，在這一領(lǐng)域中，最值得一提是大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell sequencing）技術(shù)，能獨(dú)立地提供每個(gè)細(xì)胞的DNA或RNA表達(dá)譜，并鑒定異質(zhì)細(xì)胞群中的稀有細(xì)胞。今天小編就給大家分享一篇近期發(fā)表在nature communications上面的關(guān)于單細(xì)胞測(cè)序在免疫方面應(yīng)用的文獻(xiàn)。

技術(shù)路線：

研究成果：
1.TAK-003可產(chǎn)生強(qiáng)效持久的細(xì)胞免疫
流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了55個(gè)人在TAK-003免疫后第0、14、28、120天的T細(xì)胞活化程度，發(fā)現(xiàn)在接種后第28天時(shí)CD8+T活化(通過(guò)CD38 / HLA-DR上調(diào)評(píng)估)達(dá)到峰值,并在第120天返回基線水平。觀察到CD4+ T活化峰值為疫苗接種后第14天，但此時(shí)CD8 + T無(wú)產(chǎn)生IFN-γ功能。

2.鑒定抗原特異性CD8 +記憶T細(xì)胞
利用單細(xì)胞RNA測(cè)序跟蹤來(lái)自急性激活時(shí)間點(diǎn)和記憶時(shí)間的TAK-003反應(yīng)性CD8 + T的克隆/收縮。IFN-γELISPOT分析TAK-003給藥后第120天的PBMC樣品，其表現(xiàn)出強(qiáng)偏向NS1（蛋白質(zhì)非結(jié)構(gòu)域）和NS3的記憶T細(xì)胞反應(yīng)。NS1或NS2反應(yīng)性記憶CD8 + T早期激活標(biāo)志物CD25和CD69上調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)分選CD8 + CD25 + CD69 + T，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，疫苗接種后第120天NS1-和NS3-反應(yīng)性記憶CD8 + T細(xì)胞表現(xiàn)出TCR克隆型多樣性。

3.TAK-003刺激的CD8 + T細(xì)胞的特征
評(píng)估CD8 + CD38 + HLA-DR + T細(xì)胞的表達(dá)譜，揭示四個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)不同的群體。與效應(yīng)CD8 + T相關(guān)的基因GZMA、GZMB和PRF1等顯著富集于Cluster1中，靜息和na?ve T相關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因如CCR7、MAL和TCF7等在Cluster2、Cluster3中富集，與細(xì)胞代謝、增殖和細(xì)胞周期有關(guān)基因如TYMS，IDH2和GAPDH在Cluster1中富集。在接種120天后的1003個(gè)CD38 + HLA-DR + CD8 + T細(xì)胞中，14.5％的細(xì)胞表達(dá)NS1-和NS3-反應(yīng)性記憶細(xì)胞的TCRs。表達(dá)克隆TCR的細(xì)胞優(yōu)先富集在Cluster1。

4. 活化多克隆T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝
體外刺激，CD4 +和CD8 + T細(xì)胞顯示出激活標(biāo)記分子上調(diào)，TCR刺激后TfR1和CD98的表達(dá)持續(xù)增，2-NBDG和BODIPY FLC16攝取增加。

5. 活化克隆T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝
病毒 - 抗原刺激的CD8 + T的片段能觀察到顯著的供體 - 供體變異性，具有最豐富的CD8 + T活化響應(yīng)于CMV肽刺激。除了上調(diào)CD69和CD25的表達(dá)，CD98 、TfR1的表達(dá)增加，對(duì)CD8 + T對(duì)BODIPY FLC16的攝取增加。 hCMV、腺病毒或流感內(nèi)， （CD25 / CD69的上調(diào)與TfR1、CD98的表達(dá)或攝取 BODIPY FL-C16增加。有很大程度的相關(guān)性。

6.體內(nèi)T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝
TfR1 / CD98表達(dá)以及BODIPY FL-C16和2-NBDG攝取，用于鑒定體外抗原特異性激活的T細(xì)胞的功能表征。為確定這些標(biāo)記是否可以用于剖析體內(nèi)激活的疫苗反應(yīng)性T細(xì)胞的功能異質(zhì)性，比較了常規(guī)活化標(biāo)記物CD38 / HLADR的表達(dá)和細(xì)胞攝取2-NBDG和BODIPY FL-C16的能力，和代謝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TfR1和CD98的上調(diào)。TAK-003給藥引起強(qiáng)效CD8 + T 應(yīng)答，第28天達(dá)到峰值。與單細(xì)胞RNA測(cè)序表型一致，2-NBDG和BODIPY FL-C16攝取均顯著增加。HLA-DR陽(yáng)性中CD8 + T上調(diào)表達(dá)TfR1和CD98。

7.TfR1表達(dá)與效應(yīng)/記憶潛能相關(guān)
為研究TfR1在體內(nèi)活化的CD8 + T細(xì)胞表面表達(dá)的差異是否可用于確定它們的效應(yīng)/記憶潛力，利用單細(xì)胞RNA測(cè)序來(lái)評(píng)估TAK-003給藥14天后記憶前體CD8 + T克隆型的相對(duì)豐富。在接種TAK-003 14天后，分選出先前單細(xì)胞測(cè)序中使用的同一個(gè)體的TfR1 + HLA-DR + CD8 + T 并進(jìn)行測(cè)序分析，117個(gè)人的TAK-003反應(yīng)細(xì)胞具有80種獨(dú)特的TCR克隆，其中有31和24個(gè)NS1-和NS3-反應(yīng)性記憶前體細(xì)胞。只有一部分CD38 + HLA-DR +CD8 + T在TAK-003刺激后14天表達(dá)TfR1， TfR1表達(dá)與細(xì)胞增殖標(biāo)記（Ki67）、細(xì)胞溶解功能（Granzyme B）和效應(yīng)/記憶譜系（EOMES）存在相關(guān)。

總結(jié)：
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不僅應(yīng)用于免疫相關(guān)研究，在腫瘤等各領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛，單細(xì)胞測(cè)序正在成為科研熱點(diǎn)。