揭秘一種新的circRNA,通過海綿miRNA調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響膀胱癌的進(jìn)展

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2019-10-16
膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是世界上最流行的惡性腫瘤之一。在中國(guó),膀胱癌的死亡率和發(fā)病率在所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中排名第一......

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是世界上最流行的惡性腫瘤之一。在中國(guó),膀胱癌的死亡率和發(fā)病率在所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中排名為第一。根據(jù)腫瘤侵襲的深度,膀胱癌可分為兩類:非肌肉侵襲性腫瘤(70~80%)和肌層浸潤(rùn)性腫瘤(20~30%)。對(duì)于肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者,轉(zhuǎn)移的發(fā)生更為頻繁,預(yù)后較差。即使在接受手術(shù)和化療最佳治療的肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者中,由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,5年總生存率僅為60%。因此,闡明推動(dòng)膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制具有重要的臨床意義,這將有助于開發(fā)更有效的抗癌療法。
circRNA是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA分子,其基本特征為共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu),沒有5'帽和3'poly尾。與線性RNA不同,circRNA通常源自外顯子或內(nèi)含子的反向剪接事件。反向互補(bǔ)序列(包括反向重復(fù)Alu對(duì)和外顯子跳躍)有助于circRNA形成。circRNAs的顯著特征包括強(qiáng)穩(wěn)定性,高豐度,進(jìn)化保守和組織特異性表達(dá)。盡管多年前報(bào)道circRNA,但這些分子首先被認(rèn)為是剪接錯(cuò)誤的產(chǎn)物。RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的全基因組分析已經(jīng)鑒定出大量的circRNA,并證明它們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中是內(nèi)源的,豐富的和保守的。近年來(lái)已經(jīng)鑒定出circRNA的多種特性,由于一些circRNA具有miRNA結(jié)合位點(diǎn),其作為“miRNA海綿”的作用最常被討論。CircRNAs海綿miRNA來(lái)阻止其對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)。然而, circRNA在膀胱癌中的作用很少被報(bào)道。膀胱癌中circRNA的生物學(xué)功能很大程度上未知,需要進(jìn)一步研究。
6月份,Lu Q等人發(fā)表一篇“Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN”的SCI文章,IF=10.679,這項(xiàng)研究鑒定了源自SLC8A1基因的circRNA,稱為circSLC8A1。circSLC8A1的表達(dá)在膀胱癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào),并且與膀胱癌的臨床分期和分級(jí)呈正相關(guān)。這篇文獻(xiàn)也提出了假設(shè),即circSLC8A1可能通過海綿miR-130b和miR-494來(lái)影響PTEN的表達(dá)參與膀胱癌的進(jìn)展。
技術(shù)路線:

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一、circSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中顯著下調(diào)

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圖1A.circSLC8A1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)。示意圖顯示了形成circSLC8A1的SLC8A1外顯子1的環(huán)化。RT-PCR證實(shí)了circSLC8A1的存在,Sanger測(cè)序驗(yàn)證其反向剪接位點(diǎn)。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊剪接位點(diǎn)。BCqRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了與其鄰近的正常組織相比,70對(duì)人膀胱癌組織中circSLC8A1表達(dá)水平降低。D.qRT-PCR檢測(cè)SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞系中circSLC8A1的表達(dá)水平。E.RT-PCR在5637和T24細(xì)胞系中驗(yàn)證circSLC8A1的表達(dá)情況。引物擴(kuò)增cDNA中的circSLC8A1但不擴(kuò)增基因組DNA(gDNA),GAPDH作為陰性對(duì)照。F.qRT-PCR檢測(cè)RNaseR處理或不處理后的5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達(dá)情況。將circSLC8A1和SLC8A1mRNA的相對(duì)水平標(biāo)準(zhǔn)化為模擬處理中測(cè)量的值。數(shù)據(jù)是平均值±SD,n=3。

二、過表達(dá)circSLC8A1抑制膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲

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圖2 過表達(dá)circSLC8A1抑制膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲。A. 轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ召|(zhì)粒后,qRT-PCR檢測(cè)5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達(dá)水平。B. wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。CD. 轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ召|(zhì)粒后, transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力。E. 5637和T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種sicircSLC8A1,qRT-PCR檢測(cè)每種sicircSLC8A1對(duì)circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效率。F. wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在5637和T24細(xì)胞中sicircSLC8A1-1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。GH transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1敲減后對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。數(shù)據(jù)是平均值±SD,n=3。
三、circSLC8A1 充當(dāng)膀胱癌細(xì)胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿

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圖 3 circSLC8A1 充當(dāng)膀胱癌細(xì)胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿。A和B. 通過Pulldown下拉并用circSLC8A1 特異性探針富集5637, T24 和 SV-HUC-1 細(xì)胞裂解液中的 circSLC8A1,然后通過 qRT-PCR 檢測(cè)circSLC8A1 的表達(dá)水平, GAPDH 用作陰性對(duì)照。C,D 和 E.通過 circSLC8A1 下拉miRNA,并且通過circSLC8A1 探針在 5637 和 T24 細(xì)胞中下拉 miR-130b 和 miR-494。 qRT-PCR 檢測(cè) 5637, T24 和 SV-HUC-1細(xì)胞裂解液中 7 種 候選miRNA的相對(duì)水平。F 和 G 將生物素化的 miR-130b 或 miR-494 轉(zhuǎn)染到 5637 和 T24 細(xì)胞中,鏈霉抗生物素蛋白捕獲后,通過 qRT-PCR 定量 circSLC8A1 水平。H 和 I.免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在 T24細(xì)胞中的 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的 表達(dá)情況。細(xì)胞核染成藍(lán)色(DAPI), circSLC8A1 染成紅色, miR-130b / miR-494 染成綠色。數(shù)據(jù)是平均值±SD,n = 3。
四、miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展

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圖 4 miR-130b 和 miR-494 通過靶向 PTEN 促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。 A和B. qRT-PCR 結(jié)果顯示與正常的鄰近膀胱組織相比, 在膀胱癌組織(n = 30)中miR-130b 和 miR-494的表達(dá)上調(diào)。 C和D Pearson分析顯示 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。 E和 F CCK-8 結(jié)果實(shí)驗(yàn)顯示 miR-130b 和 miR-494 促進(jìn) 5637 和 T24 細(xì)胞的增殖。G 和 H Transwell 遷移和侵襲結(jié)果表明5637 和 T24 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-130b 或 miR-494 mimics促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。IJ. 5637 和 T24 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 anti-miR-130b 或 anti-miR-494 抑制細(xì)胞遷移和侵襲。K.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè) PTEN mRNA 的 3'-UTR 中的 miR-130b / miR-494 結(jié)合位點(diǎn)。 L.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) miR-130b / miR-494 和 PTEN mRNA 之間的相互作用。M. miR-130b 和 miR-494 分別下調(diào)了 PTEN 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)是平均值±SD,n = 3
五、circSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)并抑制膀胱癌進(jìn)展

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圖 5 circSLC8A1 通過靶向 miR-130b 和 miR-494 調(diào)節(jié) PTEN 表達(dá)并抑制膀胱癌進(jìn)展。 A,B和 C. Transwell和 CCK-8 實(shí)驗(yàn)證明circSLC8A1 抑制 5637 和 T24 細(xì)胞的侵襲能力和增殖,然而用 miR-130b 或 miR-494 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),抑制作用被逆轉(zhuǎn)。D 和 E. 蛋白質(zhì)印跡顯示, miR-130b 和 miR-494 可以部分降低 PTEN 蛋白的表達(dá)水平,這是由 circSLC8A1 促進(jìn)的。 F. 蛋白質(zhì)印跡分析 10 個(gè)配對(duì)的人膀胱癌標(biāo)本和正常相鄰組織樣本中的 PTEN 蛋白。數(shù)據(jù)是平均值±SD,n = 3。
六、circSLC8A1抑制體內(nèi)膀胱癌腫瘤的生長(zhǎng)

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圖 6 circSLC8A1 抑制體內(nèi)膀胱癌腫瘤的生長(zhǎng)。A. circSLC8A1 或?qū)φ蛰d體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 T24 細(xì)胞的皮下注射到裸鼠中,建立皮下異種移植腫瘤(每組 n = 6)。 B. 裸鼠中異種移植物腫瘤形成的代表圖。 C.D. 與對(duì)照載體組相比,circSLC8A1 處理的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度和體重明顯下降。E.通過 qRT-PCR 在腫瘤組織中檢測(cè)circSLC8A1, miR-130b 和 miR-494 的表達(dá)水平。F. 在異種移植物中使用 IHC 染色測(cè)量 PTEN, AKT,p-AKT 和 MMP9 的表達(dá).