重磅：Nature揭示H3K36me3介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程中RNA m6A修飾

  近期，m6A修飾領(lǐng)域大牛在nature上發(fā)表了關(guān)于RNA上m6A修飾時(shí)如何添加到特定部位的研究結(jié)果（doi: 10.1038/s41586-019-1016-7）。小編在這分享給大家，一定能對(duì)大家的研究有所幫助。
  m6A是真核生物mRNA上的一種最常見的修飾，越來越多的研究揭示了m6A在mRNA穩(wěn)定性、翻譯，以及在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、應(yīng)答等過程中發(fā)揮著重要作用。m6A主要集中于含RRACH的motif上，而且主要分布于CDS和3’UTR區(qū)域。雖然體外實(shí)驗(yàn)中，METTL3–METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶能識(shí)別該motif，但體內(nèi)只有部分motif上存在m6A，而且分布區(qū)域存在特異性。因此作者提出問題：體內(nèi)特定轉(zhuǎn)錄本和位點(diǎn)的m6A修飾是如何調(diào)控的？
  通過比較m6A與各種類型的組蛋白修飾的分布情況，作者發(fā)現(xiàn)H3K36me3與m6A的分布存在69.2%的重合（圖一）。同時(shí)，在不同組織和細(xì)胞系中，SETD2(注：H3K36me3主要甲基轉(zhuǎn)移酶)和METTL3、METTL14及WTAP的mRNA水平呈現(xiàn)正相關(guān)。因此作者猜想二者存在聯(lián)系。

                                               圖1 m6A與常見組蛋白修飾分布重合分析結(jié)果
  通過敲除SETD2或過表達(dá)KDM4A降低細(xì)胞內(nèi)H3K36me3水平后，細(xì)胞內(nèi)總RNA和poly-A RNA上的m6A修飾水平也顯著降低；該降低效果與單獨(dú)敲除各m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的作用一致（圖2a）。小鼠模型也得到同樣的結(jié)果。在SETD2敲除細(xì)胞中回復(fù)過表達(dá)SETD2可以回復(fù)H3K36me3和m6A水平（圖2b）。反過來，敲低m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（the m6A methyltransferase Complex, MTC）成員后對(duì)H3K36me3整體水平無顯著影響。

                                               圖2 H3K36me3影響m6A水平
  m6A-seq和H3K36me3 ChIP-seq結(jié)果顯示了二者分部有顯著的相關(guān)性。在SETD2敲除后，H3K36me3下降的區(qū)域中約有50%區(qū)域的m6A水平也顯著下降。而KDM4A（H3K36me3主要去甲基化酶）過表達(dá)后，也是同樣的表型。接下來作者通過核酸酶活性突變的Cas9蛋白融合表達(dá)SETD2和KDM4A，然后使用sgRNA導(dǎo)向特異位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)該位點(diǎn)的H3K36me3改變。在原本無H3K36me3修飾的位點(diǎn)特異性的導(dǎo)入SETD2并上調(diào)H3K36me3后，該位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的mRNA上的m6A修飾也從無法檢測(cè)變?yōu)轱@著上升；而導(dǎo)入KDM4A的結(jié)果則相反。這些結(jié)果
進(jìn)一步說明了H3K36me3能上調(diào)進(jìn)該部位轉(zhuǎn)錄本的m6A水平。

                                      圖3 位點(diǎn)特異修飾H3K36me3能調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)m6A水平
  敲低SETD2后，作者檢測(cè)到MTC與其靶向mRNA的結(jié)合能力顯著降低；而MTC基因的表達(dá)和蛋白間相互作用沒有收到影響。因此作者推測(cè)H3K36me3能夠招募MTC至相應(yīng)部位。作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)H3K36me3能直接與MTC結(jié)合，而且不依賴于RNA或DNA。而且MTC只特異性的結(jié)合H3K36me3，而不結(jié)合H3K36me1和H3K36me2。MTC中，METTL14負(fù)責(zé)識(shí)別H3K36me3。那這種識(shí)別是否是直接相互作用呢？作者沒有發(fā)現(xiàn)已知的H3K36me3 reader能與METTL14相互作用，但在體外實(shí)驗(yàn)中作者檢測(cè)到了H3K36me3和METTL14之間的直接相互作用。截?cái)鄬?shí)驗(yàn)也進(jìn)一步分析了METTL14識(shí)別H3K36me的核心區(qū)域。如圖4所示。

                                                圖4 METTL14與H3K36me3作用機(jī)制研究
  既然METTL14能結(jié)合H3K36me3，那它是否與染色質(zhì)結(jié)合呢？作者使用HA標(biāo)簽抗體通過ChIP-seq檢測(cè)了METTL14在染色質(zhì)上的定位，而這一分布與H3K36me3有顯著的相關(guān)性。而PAR-CLIP檢測(cè)METTL14在RAN上的分布也于該結(jié)果一致。如圖5所示。

                                      圖5 METTL14和染色質(zhì)和RNA定位與H3K36me3和m6A相關(guān)性分析
  文獻(xiàn)報(bào)道中，H3K36me3參與的功能較多，其中包括轉(zhuǎn)錄延伸。作者探討了POII S2P在METTL14調(diào)節(jié)這一過程中的作用。最后得出結(jié)論：METTL14能直接識(shí)別和結(jié)合H3K36me3而不依賴于POII S2P，進(jìn)而在POII介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸過程中直接甲基化新生RNA（圖6）。最終，作者在胚胎干細(xì)胞的更新和分化過程中探究了這一分子機(jī)制的生物學(xué)意義。通過敲低SETD2降低H3K36me3水平后，胚胎干細(xì)胞中m6A水平和分化狀態(tài)都顯著下降。

                                        圖6 METTL14在轉(zhuǎn)錄過程中識(shí)別H3K36me3并催化m6A模式圖

                                     圖7 下調(diào)H3K36me3能減少m6A水平和抑制小鼠胚胎干細(xì)胞分化
  該研究不僅系統(tǒng)地揭示了m6A主要分布于CDS和3’UTR區(qū)域的分子機(jī)制，更是發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)上的組蛋白修飾與RNA上的修飾存在調(diào)節(jié)關(guān)系。這為我們研究基于表達(dá)調(diào)控提供了新的思路。