外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用

   外泌體被認為是體內(nèi)所有細胞釋放并參與細胞間通訊的小囊泡，盡管有證據(jù)表明神經(jīng)元和其他類型細胞在大腦中分泌的外泌體具有神經(jīng)生物學作用，但它們在人類神經(jīng)回路發(fā)育功能上很大程度上尚未開發(fā)。近日，綜合性期刊PNAS發(fā)表了一篇題名為：Exosomes regulate neurogenesis and circuit assembly的文章。文章結(jié)果表明外泌體攜帶調(diào)節(jié)神經(jīng)回路發(fā)育所需的信號信息。

一、外泌體增加發(fā)育神經(jīng)細胞的細胞數(shù)量
   為了驗證外泌體在神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮生理作用的假設(shè)，外泌體的來自誘導多能干細胞（hiPSC）的神經(jīng)培養(yǎng)物。WB分析表明，純化的外泌體含有典型外泌體標記。電子顯微鏡顯示的外泌體具有典型的形狀，大小范圍為30-200nm; 約60％的外泌體在40和80nm之間。通過EdU檢測外泌體對人類原代神經(jīng)培養(yǎng)物中的增殖的影響。外泌體用熒光膜標記物標記，觀察外泌體是否定位受體細胞。與對照組相比，外泌體處理的培養(yǎng)物中細胞數(shù)量有統(tǒng)計學意義的顯著增加。
二、外泌體增加小鼠齒狀回的體內(nèi)增殖
   作者測量出生后P4小鼠齒狀回GCL中的神經(jīng)增殖，測試外泌體是否在體內(nèi)具有生物活性并且可以在神經(jīng)回路中影響細胞增殖，其中顆粒細胞增殖在出生后早期持續(xù)。收獲嚙齒類DIV9原代神經(jīng)培養(yǎng)物的外泌體并將其注射到P4小鼠的側(cè)腦室，對照組注射蛋白酶K處理的外泌體。然后注射給予EdU（25mg/kg）。24小時后處理小鼠大腦，用DAPI，Nestin和EdU標記。小鼠DIV19外泌體注入EdU+細胞有顯著增多。這些數(shù)據(jù)表明，外泌體在體內(nèi)顯示出生物活性，增加神經(jīng)細胞增殖，類似于它們在神經(jīng)培養(yǎng)中的作用。

三、蛋白質(zhì)組學分析表明外泌體含有缺乏MECP2的信號蛋白
   為了探索蛋白質(zhì)可能參與神經(jīng)回路發(fā)育中的外泌體細胞間信號傳導能力的想法，分析了外泌體的蛋白質(zhì)組，其中單個蛋白MECP2的功能性損傷對大腦發(fā)育具有破壞性影響。比較雄性個體的供體hiPSC衍生神經(jīng)培養(yǎng)物的外泌體，其中MECP2蛋白完全不存在（MECP2LOF），對照組hiPSC衍生的神經(jīng)培養(yǎng)物，使用CRISPR / Cas9技術(shù)校正MECP2突變（isoCONTROL）。結(jié)果表明，hiPSC衍生的神經(jīng)培養(yǎng)物釋放的外泌體富含影響神經(jīng)元發(fā)育和功能的蛋白質(zhì)。它們包含對蛋白質(zhì)翻譯，軸突指導，整聯(lián)蛋白信號，肝配蛋白信號傳導和細胞骨架調(diào)節(jié)信號傳導組分，進而影響下游功能，例如軸突形成，發(fā)展，形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)元的增殖，和突觸發(fā)育和功能。在MECP2LOF和isoCONTROL外泌體2,572種蛋白質(zhì)中，237種在MECP2LOF和isoCONTROL樣品之間具有1.5倍或更大倍數(shù)差異。使用GO和KEGG進行數(shù)據(jù)富集分析，結(jié)果表示主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生。軸突引導，肝配蛋白信號傳導和肌動蛋白動力學差異最顯著。進一步分析預測參與神經(jīng)元增殖的30種蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集和預測參與神經(jīng)元發(fā)育的44種蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集。2個數(shù)據(jù)集之間存在重疊，與注釋的蛋白質(zhì)一致，在神經(jīng)元增殖和發(fā)育中發(fā)揮功能。這些定量蛋白質(zhì)組學和生物信息學分析表明，外泌體含有在復雜功能信號網(wǎng)絡(luò)中相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被MECP2突變顯著改變。使用WB測試在從供體MECP2LOF培養(yǎng)釋放外泌體特異性蛋白質(zhì)的改變。MECP2LOF和isoControl外泌體之間的物質(zhì)差異在很大程度上與其細胞表達無關(guān)。盡管HRAS和Alix在isoCONTROL和MECP2LOF細胞裂解物中顯示出相似的水平，但與外泌體中的isoCONTROL相比，MECP2LOF中的Alix降低且HRAS未改變。與isoCONTROL相比，使用MECPLOF的Flotillin，Cadherin 2，Calmodulin 1，GAP43和L1CAM顯示出更高的蛋白質(zhì)水平。相反，F(xiàn)lotillin和GAP43在MECP2LOF外泌體中減少，而鈣粘著蛋白2和L1CAM沒有變化。這些結(jié)果表明，MECP2功能喪失導致外泌體中特定的蛋白質(zhì)改變，并且外泌體蛋白質(zhì)不僅僅是細胞改變的復制品。外泌體貨物差異包裝的機制尚未闡明。

四、控制組外泌體增加增殖和神經(jīng)元分化，而MECP2LOF外泌體沒有作用
   蛋白質(zhì)組學分析預測MECP2LOF和對照外泌體可能對細胞增殖和神經(jīng)元分化具有不同的作用。為了驗證這些假設(shè)，處理的受體的人原代神經(jīng)培養(yǎng)物與來自MECP2LOF外泌體或?qū)φ展w培養(yǎng)物。在DIV 7上，培養(yǎng)物在添加外泌體之前接受10μMEdU的2小時孵育。與無外泌體處理相比，isoCONTROL外泌體處理使EdU標記的子代顯著增加，而用MECP2LOF外泌體處理與單獨添加培養(yǎng)基相當。這些數(shù)據(jù)表明，對照外泌體促進了NPC增殖和EdU標記后代的存活，而這些增殖和存活信號在MECP2LOF外泌體中缺乏，與我們的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析一致。
   接下來研究響應外泌體處理產(chǎn)生的細胞是否分化成神經(jīng)元，我們用EdU孵育，然后用雙皮質(zhì)素（DC）對培養(yǎng)物進行免疫標記，以鑒定星形膠質(zhì)細胞。與對照組相比，isoCONTROL外泌體處理使EdU+DC+雙標記神經(jīng)元顯著增加，而MECP2LOF外泌體處理不影響EdU+DC+雙標記的神經(jīng)元數(shù)目。與單獨添加培養(yǎng)基相比，isoCONTROL和MECP2LOF外泌體處理均增加了EdU+GFAP+雙標記的星形膠質(zhì)細胞數(shù)目。這些結(jié)果表明，isoCONTROL外泌體可增強神經(jīng)元的增殖并擴展神經(jīng)元庫。盡管MECP2LOF和對照組外泌體具有增強星形膠質(zhì)細胞形成的等效能力，但MECP2LOF外泌體缺乏影響神經(jīng)元的信號。這些結(jié)果與蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析一致，可預測外泌體物質(zhì)的神經(jīng)源性作用，證明了在Rett綜合征小鼠模型中星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的非細胞自主信號傳導的有益作用。

五、isoCONTROL外泌體恢復MECP2敲減神經(jīng)細胞中的神經(jīng)元數(shù)量。
   MECP2 shRNA或?qū)φ战M慢病毒添加到人原代神經(jīng)培養(yǎng)物DIV 3， isoCONTROL外泌體孵育。將純化的外泌體連續(xù)倍比稀釋至0.5x和0.25x相對濃度測試isoCONTROL外泌體對MECP2敲低培養(yǎng)物的影響，研究劑量與生物活性的關(guān)系。將培養(yǎng)物固定在DIV13上并用神經(jīng)元標記物Synapsin和DAPI進行免疫標記。使用胰島素樣生長因子1（IGF1）作為陽性對照。沒有外泌體，MECP2KD與SH相比，總細胞數(shù)和神經(jīng)元數(shù)下降。盡管1×劑量的對照外泌體無效，但與IGF處理的部分恢復相比，0.5×和0.25×劑量產(chǎn)生完全恢復。用對照sc Scrambled病毒處理神經(jīng)培養(yǎng)物，添加從hiPSC衍生的神經(jīng)供體培養(yǎng)物中收獲的MECP2LOF外泌體。將1×原液連續(xù)稀釋至0.5×和0.25×來測試3劑MECP2LOF外泌體。將培養(yǎng)物固定在DIV13上并用Synapsin和DAPI免疫標記以分別確定神經(jīng)元和總細胞的數(shù)量。與單獨添加培養(yǎng)基相比，用isoCONTROL外泌體處理增加了總細胞數(shù)和神經(jīng)元數(shù)量，外泌體MECP2LOF沒有表現(xiàn)出對總細胞數(shù)或神經(jīng)元的數(shù)目產(chǎn)生不利的影響。與此相反，在0.5×劑量MECP2LOF外泌體與對照培養(yǎng)物相比，增加了總細胞數(shù)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學分析，結(jié)果表明，isoControl外泌體含有可能根據(jù)劑量和受體細胞狀態(tài)而具有不同結(jié)果的信號通路，MECP2LOF外泌體缺乏增加神經(jīng)元分化的信號。

六、對照組外泌體處理增加hiPSC衍生的神經(jīng)元中的突觸密度
   與對照組神經(jīng)元相比，人神經(jīng)元培養(yǎng)物中的MECP2敲低降低了突觸和活動驅(qū)動的鈣變。并驗證同基因?qū)φ战M外泌體是否具有拯救這些突觸和回路缺陷的能力。將MECP2LOF hiPSC衍生的NPC分化為成熟的6周齡神經(jīng)培養(yǎng)物，并在8天內(nèi)用1×或0.25×劑量的對照組外泌體處理培養(yǎng)物。在外泌體處理后，將培養(yǎng)物固定并用MAP2標記神經(jīng)元和Synapsin1標記突觸前斑點。與沒有外泌體處理的培養(yǎng)物相比，用低劑量對照組外泌體處理的神經(jīng)培養(yǎng)物具有顯著更高的斑點密度。這表明在可見突觸密度的增加可能是由于低強度斑點的增加引起的。這些數(shù)據(jù)表明對照外泌體增加了MECP2LOF hiPSC衍生的神經(jīng)培養(yǎng)物中的突觸發(fā)生。
   使用多電極陣列（MEA）測量網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元活動和連通性。為了測試外泌體處理是否影響電路發(fā)育，我們分析了用對照組外泌體處理的神經(jīng)球中的神經(jīng)元放電與MECP2LOF外泌體孵育相比，其似乎對神經(jīng)元分化沒有有害影響。神經(jīng)球用外泌體處理4次以上，并評估了MEA的活動。結(jié)果顯示用MECP2LOF外泌體處理的神經(jīng)球中的神經(jīng)元放電是稀疏的并且跨電極的活性不同步。相比之下，用對照組外泌體處理增加了MECP2LOF神經(jīng)球中的神經(jīng)元活性。用對照組外泌體處理的神經(jīng)球比用MECP2LOF外泌體處理的神經(jīng)球具有更多的通道活性和更多的活性通道。此外，與用MECP2LOF外泌體處理的神經(jīng)球相比，用對照組外泌體處理的神經(jīng)球中的多個通道的更多同步活性，表明對照組外泌體處理增加MECP2LOF神經(jīng)球中的神經(jīng)元和網(wǎng)絡(luò)活性?？傊@些結(jié)果表明，對照組外泌體處理能夠增加突觸前的斑點密度并增加神經(jīng)回路中的活性。

總結(jié)
   作者的數(shù)據(jù)證明神經(jīng)外泌體具有細胞間信號傳導生物活性，其在神經(jīng)發(fā)育疾病模型中具有功能性影響。此外，結(jié)果顯示外泌體能夠逆轉(zhuǎn)MECP2突變體神經(jīng)元中觀察到的一些病理表型，表明外泌體可能在腦疾病中具有治療應用。