lncRNA EMS 將c-Myc和細胞周期調(diào)控以及腫瘤發(fā)生聯(lián)系在一起

導(dǎo)語：
c-Myc的表達失調(diào)是癌癥的重要分子標志。 c-Myc的致癌功能很大程度上歸因于其作為主要轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)在本質(zhì)。 在這里，將報告一種長鏈非編碼RNA（lncRNA）E2F1信使RNA（mRNA）穩(wěn)定因子（EMS）作為c-Myc的直接轉(zhuǎn)錄目標。 EMS通過促進G1 / S細胞周期進程而充當致癌分子。 從機理上講，EMS與RNA結(jié)合蛋白RALY協(xié)同作用來穩(wěn)定E2F1 mRNA，從而增加E2F1的表達。此外，EMS能夠通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性將c-Myc連接到細胞周期控制和腫瘤發(fā)生。 總而言之，這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種未發(fā)現(xiàn)的機制，即c-Myc誘導(dǎo)E2F1表達的機制，也暗示EMS是調(diào)節(jié)c-Myc功能的重要參與者。

技術(shù)路線：
1、使用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫分析找出具有致癌功能的c-Myc反應(yīng)性lncRNA
2、通過實時RT-PCR或Western印跡分析驗證了成功的慢病毒介導(dǎo)的敲低和過表達。
3、ASO的轉(zhuǎn)染，實時RT-PCR，5′ RACE and 3′ RACE. 5
4、RNA原位雜交確定EMS，RNA在細胞中的分布
5、合成EMS及其反義RNA進行體外轉(zhuǎn)錄
6、生物素下拉檢查EMS和RALY裂解物之間的相互作用
7、ChIP分析、異種移植小鼠模型、

研究結(jié)果：1.EMS通過促進G / S細胞周期進程而充當致癌lncRNA使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析, ENCODE c-Myc染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)集的分析表明EMS為分子大小為1,098 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，主要位于細胞質(zhì)中。數(shù)據(jù)表明EMS促進細胞增殖。確定了EMS促進細胞增殖并評估了EMS對細胞周期分布的影響。后面證明了EMS通過加速G1 / S細胞周期進程來促進細胞增殖。再進行了軟瓊脂菌落形成試驗、異種移植小鼠模型，顯示出EMS基因敲低可強烈抑制A549細胞的體內(nèi)異種移植腫瘤生長。TCGA數(shù)據(jù)庫的分析，LUAD，LUSC，COAD和乳腺浸潤性癌（BRCA）中的EMS表達水平升高。此外，腫瘤細胞系A549，PC9和H1299具有更高的EMS拷貝數(shù)。

2 .EMS是c-Myc的直接轉(zhuǎn)錄目標
通過RNA測序分析，EMS被鑒定為c-Myc反應(yīng)性lncRNA。證明c-Myc的誘導(dǎo)增加，而c-Myc的敲低減少，A549，PC9，H1299，HCT116和MCF7細胞中的EMS表達，表明c-Myc對EMS表達的特異性作用。根據(jù)c-Myc和EMS細胞表達之間的關(guān)系，對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析表明，c-Myc和EMS的表達水平在LUAD，LUSC，COAD和BRCA中呈正相關(guān)。接下來，使用JASPAR數(shù)據(jù)庫檢查EMS基因的上游和內(nèi)含子區(qū)域（43）。確定了三個推定的c-Myc結(jié)合位點（D1，D2和D3。此外，對ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集的分析表明，在EMS的轉(zhuǎn)錄起始位點周圍存在c-Myc和活性組蛋白標記H3K4me3。 ChIP分析驗證了c-Myc與包含D2位點的染色質(zhì)片段的相互作用。使用了基于pGL3的熒光素酶報告基因構(gòu)建表明EMS受c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3.MS通過增加E2F1表達發(fā)揮其致癌作用
EMS的敲低或過表達均未顯示影響IFT22和lncPRESS1的表達水平?；虮磉_譜分析。敲出EMS導(dǎo)致987個基因的差異表達?；蚣患治霰砻?， E2F目標顯著富集。EMS對E2F1通路產(chǎn)生積極影響，對EMS過表達和敲低細胞中E2F1及其靶基因mRNA表達的積極影響。另外，EMS的異位表達增加，而EMS的敲低降低了E2F1的蛋白質(zhì)水平。TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，EMS和E2F1的表達水平在LUAD，LUSC，COAD和BRCA中呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，EMS能夠積極調(diào)節(jié)E2F1表達。EMS加速了G1 / S細胞周期的進展。通過使用異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)EMS促進了裸鼠的異種移植腫瘤生長。通過E2F1誘導(dǎo)可以極大地恢復(fù)EMS抑制性抑制異種移植瘤的生長。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明EMS通過增加E2F1表達發(fā)揮其致癌作用。

4.EMS與RALY合作提高E2F1 mRNA的穩(wěn)定性
用actinomycinD處理具有擊倒或EMS過度表達的A549細胞不同時間，以測量E2F1 mRNA的衰減。擊倒EMS會導(dǎo)致E2F1 mRNA的半衰期減少，而EMS的過表達會延長E2F1 mRNA的半衰期，表明EMS可以穩(wěn)定E2F1 mRNA。lncRNA H19確實存在于Ago2免疫沉淀物中。與H19不同，EMS沒有富含Ago2免疫沉淀物。對EMS序列的分析表明，EMS包含具有22個尿苷的聚U區(qū)段，表明RALY也可能與EMS相互作用。進RNA免疫沉淀實驗，EMS確實富集了Flag-RALY免疫沉淀。通過生物素下拉測定法也驗證了RALY-EMS的相互作用。此外，體外結(jié)合試驗表明，RALY與EMS直接相互作用，但不與它的反義RNA相互作用。證明RALY是EMS的交互合作伙伴，RALY-EMS的相互作用，RALY與EMS直接相互作用，但不與它的反義RNA相互作用。與野生型EMS相比，缺失22個尿苷的突變EMS（EMS-ΔpolyU）顯示出與RALY的結(jié)合減少，證明RALY是EMS的交互合作伙伴。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明EMS與RALY合作以促進E2F1 mRNA的穩(wěn)定性。

5. EMS通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長
評估EMS是否通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。RALY的敲除作用大大降低，而RALY的過表達則顯著增加，細胞增殖，Edu陽性細胞數(shù)量和錨定依賴性細胞生長。EMS通過RALY促進了腫瘤細胞的生長。EMS敲除對細胞增殖的抑制作用包括：異位表達的RALY可以大大逆轉(zhuǎn)Edu陽性細胞的數(shù)量，以及與錨定無關(guān)的細胞的生長。接下來，證明 EMS的異位表達顯示可加速G1 / S細胞周期的敲低細胞。此外，EMS敲低抑制的G1 / S細胞周期進程被RALY過表達顯著逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明EMS通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。

6. EMS將c-Myc連接到細胞周期控制和腫瘤發(fā)生
通過實驗數(shù)據(jù)表明c-Myc 通過促進EMS介導(dǎo)的E2F1 mRNA穩(wěn)定來調(diào)節(jié)E2F1表達。c-Myc的異位表達增強了細胞增殖，并增加了對照細胞中的正向陽性細胞的數(shù)量。細胞周期分布的分析表明，c-Myc加速的G1 / S細胞周期進程可以通過同時進行的EMS抑制來逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，c-Myc可通過促進EMS介導(dǎo)的G1 / S細胞周期進程來增加腫瘤細胞的生長。通過進行軟瓊脂菌落形成試驗，顯示c-Myc的異位表達僅能促進對照細胞中錨定非依賴性細胞的生長，而不能促進EMS抑制細胞的生長。通過使用異種移植小鼠模型，A549細胞中異位表達的c-Myc有望顯著提高異種移植腫瘤的生長。表明c-Myc可能通過EMS促進了腫瘤的生長。通過EMS抑制可將c-Myc對異種移植瘤生長的促進作用最小化。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，EMS通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性將c-Myc連接到細胞周期控制和腫瘤發(fā)生。
總結(jié) ：
作為最重要的癌基因之一，c-Myc在一半以上的人類癌癥中被激活。 c-Myc的致癌功能很大程度上歸因于其作為主要轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)在本質(zhì)。長非編碼RNA（lncRNA）的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥。 然而，lncRNA在調(diào)節(jié)c-Myc致癌活性中的功能中具有重要作用。作者發(fā)現(xiàn)作為c-Myc的轉(zhuǎn)錄靶標，lncRNA E2F1信使RNA（mRNA）穩(wěn)定因子通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)c-Myc功能。這項研究提供了有關(guān)c-Myc促進腫瘤發(fā)生機制的見解。