m6A甲基化與肥胖治療

   m6A在脂肪發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。然而，其機(jī)制在很大程度上仍不清楚。在這里，小編與大家分享一篇近期發(fā)表于AUTOPHAGY的文章“m6A mRNA methylation controls autophagy and adipogenesis by targeting Atg5 and Atg7”。我們證明了m6A通過(guò)靶向Atg5和Atg7在調(diào)控自噬和脂肪生成方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。機(jī)制上，眾所周知的m6A去甲基酶FTO的下調(diào)降低了ATG5和ATG7的表達(dá)，導(dǎo)致自噬體形成的衰減，從而抑制了自噬和脂肪生成。

結(jié)果：
1.FTO促進(jìn)自噬，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪生成

   為了探索FTO在自噬中的作用，我們首先對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行了功能缺失的研究。western blot實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，F(xiàn)TO沉默顯著降低了LC3-II:I比值，增加了SQSTM1水平，表明自噬體形成缺乏穩(wěn)態(tài)（圖1A）。相反，HA標(biāo)記的FTO過(guò)表達(dá)顯著提高了LC3-II:I比值，減少了SQSTM1表達(dá)，表明FTO與自噬呈正相關(guān)。此外，免疫熒光檢測(cè)顯示，HA-FTO過(guò)表達(dá)后形成較多的LC3小點(diǎn)（圖1B，C）。我們用透射電鏡分析了脂肪形成過(guò)程中自噬體的形成。發(fā)現(xiàn)FTO的沉默降低了自噬體的數(shù)量，表明自噬的激活程度降低。相反，F(xiàn)TO的過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量（圖1D，E）。為了確定自噬是否受FTO過(guò)表達(dá)的影響，對(duì)照組和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞分別使用或不使用其他自噬抑制劑治療。這進(jìn)一步證實(shí)FTO促進(jìn)自噬激活（圖1F，G）。
為了探討FTO是否通過(guò)自噬途徑影響脂肪生成，在脂肪生成過(guò)程中，對(duì)照組和FTO過(guò)表達(dá)的3T3-L1和豬前脂肪細(xì)胞分別使用或不使用自噬抑制劑。我們觀察到3-MA和 Baf A1治療可以逆轉(zhuǎn)增強(qiáng)的自噬，脂肪形成和FTO過(guò)表達(dá)細(xì)胞的甘油三酯積累（圖1H-J）。與表型一致，脂肪細(xì)胞標(biāo)記的mRNA和蛋白水平包括Pparg，F(xiàn)abp4和Cebpa在FTO過(guò)表達(dá)細(xì)胞明顯升高，通過(guò)3-MA或Baf A1處理可將FTO下調(diào)至正常水平（圖1K，L）。這些結(jié)果表明FTO通過(guò)促進(jìn)自噬促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。

2.FTO的下調(diào)降低了ATG5和ATG7的表達(dá)，但沒(méi)有降低ULK1的表達(dá)
   為了確定自噬中FTO的潛在靶基因，我們首先利用qPCR分析比較FTO敲低后自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在FTO敲除后，Atg5和Atg7的mRNA水平顯著降低，而Ulk1沒(méi)有變化（圖2A）。另外，F(xiàn)TO的下調(diào)顯著下調(diào)了ATG5和ATG7蛋白水平。相反，我們發(fā)現(xiàn)ULK1和其他自噬相關(guān)蛋白，如ATG12和ATG16L1，并沒(méi)有發(fā)生顯著的變化（圖2B）。此外，我們檢測(cè)了ATG5和ATG7在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)他們兩個(gè)都在早期增加，然后下降（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明，Atg5和Atg7可能是FTO的靶基因。
為了檢測(cè)ATG5和ATG7對(duì)自噬和脂肪生成的影響，我們分別用ATG5和ATG7 siRNA處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞，并使用western blot檢測(cè)其敲除效率。結(jié)果表明，LC3II:I的比值在ATG5和ATG7基因敲除后下降，F(xiàn)TO蛋白表達(dá)未發(fā)生變化（圖2D，E），這與FTO與ATG5、ATG7的上游下游關(guān)系一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)TO、ATG5和ATG7的缺失均顯著抑制脂肪生成和甘油三酯積累（圖2F-H）。而且FTO、ATG5或ATG7敲低均下調(diào)了脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)水平（圖2I，J）。這些結(jié)果表明ATG5和ATG7對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的自噬和脂肪生成具有重要的功能。因此，我們將重點(diǎn)放在這兩個(gè)FTO的潛在目標(biāo)Atg5和Atg7上進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3.FTO通過(guò)靶向ATG5和ATG7影響自噬和脂肪生成
   為了證實(shí)FTO是否通過(guò)影響ATG5和ATG7的表達(dá)而影響自噬和脂肪生成，我們首先驗(yàn)證了FTO的過(guò)表達(dá)顯著提高了ATG5和ATG7的mRNA水平（圖3A）。接下來(lái)，我們進(jìn)行了搶救實(shí)驗(yàn)，觀察到沉默ATG5可以逆轉(zhuǎn)FTO過(guò)表達(dá)3T3-L1細(xì)胞中上調(diào)的LC3-II:I比值（圖3B）。與ATG5相似，ATG7缺失也恢復(fù)了擴(kuò)增的LC3-II:I比值（圖3C），表明FTO通過(guò)調(diào)控ATG5和ATG7表達(dá)影響自噬。已有研究報(bào)道，ATG5和ATG7在前脂肪細(xì)胞中的下調(diào)通過(guò)抑制PPARG和CEBPA的表達(dá)，抑制自噬，降低CEBPB的水平，阻礙脂肪分化計(jì)劃的啟動(dòng)。這增加了FTO通過(guò)Atg5和Atg7-Cebpb信號(hào)調(diào)控脂肪生成的可能性。如我們所料，我們發(fā)現(xiàn)FTO的強(qiáng)制表達(dá)促進(jìn)了CEBPB蛋白的表達(dá)，而ATG5和ATG7的缺失則逆轉(zhuǎn)了CEBPB的表達(dá)（圖3D）。此外，敲低ATG5 和ATG7可恢復(fù)FTO過(guò)表達(dá)促進(jìn)的3T3-L1細(xì)胞的脂肪生成和甘油三酯積累（圖3 E-G）。FTO過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Pparg、Fabp4和Cebpa 的表達(dá)水平的升高也被逆轉(zhuǎn)（圖3H，I）?？偟膩?lái)說(shuō)，F(xiàn)TO通過(guò)介導(dǎo)Atg5和Atg7-Cebpb信號(hào)軸促進(jìn)脂肪生成。

4.FTO以m6A依賴的方式調(diào)控ATG5和ATG7表達(dá)
   為了進(jìn)一步闡明FTO在自噬調(diào)控中的潛在分子機(jī)制，我們構(gòu)建了野生型（FTO- wt）和催化突變體FTOR96Q （FTO- mut）質(zhì)粒，以確定是否需要FTO的去甲基酶活性。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜證實(shí)FTO-WT或FTO-MUT異位表達(dá)對(duì)細(xì)胞m6A水平的影響（圖4A）。體外表達(dá)的FTO-WT顯著增加了3T3-L1和豬脂肪細(xì)胞的LC3-II:I比值（圖4B），這意味著FTO以去甲基化酶活性依賴的方式調(diào)節(jié)自噬。一致的是，表達(dá)FTO-WT的細(xì)胞在免疫熒光檢測(cè)中顯示LC3斑點(diǎn)顯著增強(qiáng)（圖4C，D）。此外，與FTO-MUT或空載體相比，F(xiàn)TO-WT的異位表達(dá)增加了自噬體的數(shù)量（圖4E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO的去甲基化活性是前脂肪細(xì)胞自噬所必需的。接下來(lái)，我們研究了FTO是否通過(guò)去甲基化影響ATG5和ATG7的表達(dá)。與FTO-MUT或空載體相比，體外表達(dá)的FTO-WT增加了ATG5和ATG7的蛋白和mRNA水平（圖4G）。另外，在Atg5和Atg7的3’UTR處發(fā)現(xiàn)m6A修飾（圖4I）。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)敲低FTO可以增加3T3-L1和豬前脂肪細(xì)胞的m6A水平（圖4J）。此外，MeRIP-qPCR檢測(cè)顯示，F(xiàn)TO敲除顯著提高了Atg5和Atg7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的m6A水平（圖4K）。我們用RIP-qPCR，觀察到Atg5和Atg7分別與3T3-L1中HA標(biāo)記的FTO和豬前脂肪細(xì)胞中FLAG標(biāo)記的FTO相互作用，提示Atg5和Atg7是FTO的直接靶點(diǎn)（圖4L）。更重要的是，為了評(píng)估m(xù)6A對(duì)靶標(biāo)mRNA的修飾是否對(duì)FTO介導(dǎo)的基因調(diào)控是必要的，我們對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因和誘變實(shí)驗(yàn)。FTO-WT的強(qiáng)制表達(dá)顯著促進(jìn)了Atg5和Atg7的野生型3’UTR片段的活性（圖4M）。當(dāng)m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，這種增加被消除，說(shuō)明FTO通過(guò)m6A依賴方式調(diào)控ATG5和ATG7的表達(dá)。此外，染色分析顯示，F(xiàn)TO- WT促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯積累（圖4N，P），證實(shí)FTO的去甲基化活性是脂肪生成所必需的。

5.YTHDF2通過(guò)m6A依賴機(jī)制介導(dǎo)ATG5和ATG7的穩(wěn)定性和表達(dá)
   為了進(jìn)一步解釋m6A甲基化與FTO靶基因蛋白豐度之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，我們首先研究了ATG5和ATG7的表達(dá)是否受到Y(jié)THDF2或YTHDF1的影響。與對(duì)照組相比，YTHDF2的過(guò)表達(dá)顯著降低了ATG5和ATG7蛋白水平（圖5A）。而YTHDF1的強(qiáng)制表達(dá)對(duì)ATG5和ATG7的表達(dá)無(wú)影響（圖5B），說(shuō)明ATG5和ATG7是YTHDF2的靶點(diǎn)。另外，通過(guò)RIP-qPCR檢測(cè)，我們進(jìn)一步證實(shí)了Atg5和Atg7在3T3-L1和豬前脂肪細(xì)胞中都與標(biāo)記為FLAG的YTHDF2相互作用（圖5C）。接下來(lái)，我們測(cè)試了Atg5和Atg7 mRNA上的m6A修飾是否對(duì)YTHDF2介導(dǎo)的基因調(diào)控至關(guān)重要。雙熒光素酶檢測(cè)顯示異位YTHDF2顯著下調(diào)攜帶野生型Atg5和Atg7片段的熒光素酶活性（圖5D）。為了研究YTHDF2是否通過(guò)介導(dǎo)mRNA的衰減來(lái)控制Atg5和Atg7的表達(dá)，我們對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行了功能缺失研究。與對(duì)照細(xì)胞相比，YTHDF2的敲低提高了Atg5和Atg7的mRNA水平（圖5E）。mRNA穩(wěn)定性分析顯示，YTHDF2的缺失延長(zhǎng)了Atg5和Atg7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的半衰期（圖5F）。此外，通過(guò)強(qiáng)制表達(dá)YTHDF2，可以部分逆轉(zhuǎn)FTO過(guò)表達(dá)3T3-L1時(shí)ATG5和ATG7蛋白水平的升高（圖5G）。YTHDF2過(guò)表達(dá)也部分逆轉(zhuǎn)了FTO過(guò)表達(dá)細(xì)胞中LC3-II:I比值的升高。此外，異位表達(dá)YTHDF2可以逆轉(zhuǎn)FTO過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的脂肪生成和甘油三酯積累（圖5H-J）。

6.FTO可降低小鼠白色脂肪量，抑制ATG5和ATG7依賴的自噬
   為了研究FTO在體內(nèi)脂肪組織中的作用，我們將Ftoflox/flox小鼠與Fabp4-Cre小鼠雜交，建立了脂肪選擇性FTO敲除小鼠（FTO-ako）模型。FTO-ako小鼠的白色脂肪組織中FTO的表達(dá)被有效地刪除（圖6A）。與胎鼠對(duì)照小鼠相比，fto-AKO小鼠不受普通飼料或高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的體重增加的影響，而兩組之間的食物攝入量沒(méi)有顯著差異（圖6B，C）。與對(duì)照組小鼠相比，fto-AKO小鼠取食普通食物和高脂飲食上都明顯變瘦（圖6D）。另外，fto-AKO小鼠的腹股溝脂肪和性腺脂肪墊的質(zhì)量分別顯著低于對(duì)照組小鼠（圖6E，F(xiàn)）。haematine和伊紅染色顯示，取食HFD的小鼠脂肪細(xì)胞具有典型的結(jié)構(gòu)，幾乎整個(gè)細(xì)胞被一個(gè)大的脂滴所占據(jù)（圖6G，H）。相反，F(xiàn)TO缺乏會(huì)導(dǎo)致多腔和較小的脂肪細(xì)胞。此外，喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平明顯低于對(duì)照組小鼠（圖6I，J）。為了研究FTO是否影響體內(nèi)自噬，我們首先檢測(cè)了對(duì)照組和FTO-ako小鼠WAT中LC3-II:I和SQSTM1的表達(dá)水平。有趣的是，脂肪選擇性缺失的Fto顯著減弱了LC3-II:I比值，增加SQSTM1蛋白豐度（圖6K）。與體外研究一致，F(xiàn)TO缺乏減少ATG5和ATG7的蛋白和基因表達(dá)（圖6K，L）。綜上所述，這些結(jié)果表明，脂肪細(xì)胞選擇性敲除fto可以降低WAT的量，并抑制ATG5和ATG7依賴的小鼠自噬。

 

總結(jié)：
   我們的研究表明，F(xiàn)TO在m6A-YTHDF2依賴機(jī)制中，在促進(jìn)自噬和脂肪生成方面發(fā)揮著重要作用。我們的研究強(qiáng)調(diào)了m6A甲基化機(jī)制在自噬中的功能的重要性。這些發(fā)現(xiàn)為FTO和m6A修飾調(diào)節(jié)自噬和脂肪生成的分子機(jī)制，以及預(yù)防和治療肥胖的治療策略的發(fā)展提供了深入的了解。