CPX誘導(dǎo)細胞死亡和保護性自噬

   結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一。Ciclopirox olamine (ciclopirox olamine，CPX)最近被確認(rèn)為有希望的抗癌候選藥物，但其具體的作用機制還未得到進一步的研究和解釋。近日，一篇名為為“CPX Targeting DJ-1 Triggers ROS-induced Cell Deat and Protective Autophagy in Colorectal Cancer”的文章在雜志《Theranostics》上發(fā)表，該文章旨在研究CPX在結(jié)直腸癌中的作用，為下調(diào)DJ-1作為CPX抗癌活性的重要機制提供了實驗基礎(chǔ)，并為靶向細胞保護性自噬作為潛在的化療策略提供了證據(jù)。
摘要：
方法：體外和體內(nèi)檢測CPX對CRC細胞的潛在細胞毒性。在對照和CPX處理的CRC細胞之間測定整體基因表達模式、ROS水平、線粒體功能、自噬、凋亡等。
結(jié)果：發(fā)現(xiàn)CPX在體外和體內(nèi)都通過抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡來抑制CRC的生長。CPX的抗癌作用與下調(diào)DJ-1有關(guān)，過表達DJ-1可逆轉(zhuǎn)CPX對CRC細胞的細胞毒性。DJ-1的缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙和ROS積累，從而導(dǎo)致CRC生長抑制。細胞保護性自噬同時被激活，從藥理或基因上阻斷自噬可以進一步增強CPX的抗癌效果。
結(jié)論：研究表明，DJ-1丟失誘導(dǎo)的ROS積累在CPX介導(dǎo)的CRC抑制中起關(guān)鍵作用，為通過調(diào)節(jié)補償性保護性自噬來治療CRC提供了進一步的理解。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
一、CPX 抑制CRC增殖并誘導(dǎo)其凋亡

為了驗證CPX是否對CRC具有抗腫瘤作用，采用CCK8試驗評估不同種人類CRC細胞系在CPX治療下的細胞存活率。
圖1A：HCT116，DLD-1，RKO，HT29，SW480，HIEC和NCM460細胞用指定濃度的CPX處理24小時，用CCK8試劑盒測定細胞活力。圖1B：克隆形成實驗分析細胞增殖率。HCT116和SW480細胞用所指示濃度的CPX處理24小時，處理后將細胞接種于6孔板中2周，并計數(shù)集落數(shù)量。圖1C：用所指示濃度的CPX處理CRC細胞24小時后，進行EDU測定。對EDU摻入進行定量。圖1D：HCT116和SW480細胞在指示濃度CPX作用24小時后脫氫酶(LDH)釋放的分析。
結(jié)論：CPX通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性。
為了評估凋亡是否參與了CPX誘導(dǎo)的CRC細胞毒性，檢測CRC細胞的形態(tài)學(xué)變化。
圖1E：CPX處理與否HCT116和SW480細胞24小時后的形態(tài)學(xué)變化。圖1F：用20μMCPX處理HCT116和SW480細胞24h，固定，Annexin V/PI染色，流式細胞儀分析。對細胞凋亡率進行定量分析。圖1G：HCT116和SW480細胞的PARP免疫印跡分析。
結(jié)論：CPX在體外CRC細胞中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。

二、CPX誘導(dǎo)的DJ-1下調(diào)參與CPX的抗CRC作用

為了闡明CPX誘導(dǎo)CRC抑制的分子機制，確定了CPX處理細胞的整體基因表達模式，并使用RNA-seq將其與對照進行了比較。
圖2A：CPX為變量處理24小時的HCT116和SW480細胞中DEGS的火山圖分析。紅色區(qū)域表示顯著過度表達，綠色區(qū)域表示顯著下調(diào)。圖2B：對CPX為變量處理24小時的HCT116和SW480細胞進行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，檢測DJ-1mRNA的表達。圖2C：免疫印跡分析DJ-1在CRC細胞中的表達，指示濃度的CPX為變量處理24小時。
為了研究CPX誘導(dǎo)的DJ-1下調(diào)是否參與CRC抑制，評估了在CPX處理下穩(wěn)定過表達DJ-1的CRC細胞的細胞存活率和增殖。
圖2D&E：穩(wěn)定高表達DJ-1及CPX指示濃度處理的載體的CRC細胞集落形成實驗。圖2F：用CCK8試劑盒測定細胞活力。圖2G-J：將穩(wěn)定高表達DJ-1和Vector的HCT116細胞接種于裸鼠皮下(n=6)。在指定時間點監(jiān)測腫瘤體積(G)，并在euthanasia后測量腫瘤重量(H)。(I)經(jīng)載體或CPX(25 mg/kg/天)處理的小鼠產(chǎn)生的獨立腫瘤的圖像。(J)PCNA免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像和PCNA染色相對強度在異種移植物中的定量。
結(jié)論：CPX誘導(dǎo)的DJ-1下調(diào)參與了CPX的抗CRC作用。

三、DJ-1下調(diào)誘導(dǎo)的ROS是CPX抗CRC作用的機制之一

先前的研究表明，降低DJ-1會導(dǎo)致抗氧化反應(yīng)受損，檢測CPX誘導(dǎo)的DJ-1下調(diào)是否可以增加細胞ROS水平。
圖3A：通過熒光微板讀取器(Thermo Science)分析DCFH-DA染色顯示用指示濃度CPX處理的CRC細胞中的ROS水平。圖3B：用MITOSOX Red測定CPX處理后線粒體ROS水平。圖3C：用流式細胞術(shù)檢測20μMCPX處理24小時為變量，過表達Myc-DJ-1和Vector的大腸癌細胞的ROS水平。圖3D：5 mM NAC為變量的情況下，用指示濃度的CPX處理CRC細胞的菌落形成試驗。圖3E：在20μM CPX處理24小時為變量的情況下，用或不用5 mM NAC處理的大腸癌細胞的EDU測定。對EDU摻入進行定量。圖3F：CCK8比色法測定5mM NAC為變量的情況下，用所指示濃度的CPX處理CRC細胞24小時后的細胞存活率。圖3G：CPX(20μM)、載體、、NAC(5 MM)處理的HCT116和SW480細胞中PARP表達的免疫印跡分析。圖3H：固定CPX(20μM)、載體、NAC(5 MM)處理的HCT116和SW480細胞，Annexin V/PI染色，然后用流式細胞儀分析。對細胞凋亡的發(fā)展進行定量。
結(jié)論：CPX下調(diào)DJ-1并誘導(dǎo)細胞ROS積累，從而促進凋亡細胞死亡。此外，NAC的處理還降低了CPX的促凋亡效應(yīng)，如Annexin V/PI染色和裂解的PARP水平(圖3G和3H)所證明的。

四、CPX誘導(dǎo)CRC細胞線粒體功能障礙促進ROS積累

在上述研究發(fā)現(xiàn),CPX誘導(dǎo)ROS積累。
如圖3B所示，線粒體（ROS產(chǎn)生的主要來源）在CPX處理的CRC細胞中產(chǎn)生更多的超氧化物。為了評估CPX是否在CRC細胞中誘導(dǎo)線粒體改變，檢查線粒體的形態(tài)、數(shù)量和功能。圖4A：20μM CPX為變量處理的HCT116細胞的透射電鏡圖像。圖4B：通過熒光微板儀(Thermo science)，用MITOTracker Green分析經(jīng)20μM CPX為變量處理24小時的大腸癌細胞線粒體量與線粒體膜電位變化的關(guān)系。圖4C：用qRT-PCR檢測20μM CPX為變量處理24小時后HCT116和SW480細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)。圖4D：用空載體或Myc-DJ-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸癌細胞24小時，以20μM CPX為變量處理24小時，然后接種于平板12小時后進行OCR分析。基礎(chǔ)OCR在含10 mM葡萄糖，1 mMNa-Pyruvate和2 mM谷氨酰胺的XF Base培養(yǎng)基中進行分析(pH調(diào)節(jié)至7.40±0.05，37℃)(n=3)。圖4E：將10 mM葡萄糖、1μM寡霉素和50mM 2-脫氧葡萄糖(2-DG)注射于如(D)處理的HCT116細胞(n=3)后，在含有2 mM谷氨酰胺的XF Base培養(yǎng)基中進行糖酵解應(yīng)激試驗(37℃時pH調(diào)節(jié)為7.40±0.05)。圖4F&G：熱圖顯示20μM cpx處理后參與氧化磷酸化(F)和糖酵解評估(G)的基因的歸一化強度值，P值<0.0 5。圖4H&I：qRT-PCR分析20μM CPX處理后HCT116細胞氧化磷酸化(H)和糖酵解(I)相關(guān)基因的表達。
結(jié)論：CPX誘導(dǎo)線粒體功能障礙以促進ROS在CRC細胞中的積累。
接下來研究了DJ-1在ROS產(chǎn)生和線粒體功能中的作用。
圖4D：在CPX治療后，DJ-1的過表達部分恢復(fù)了CPX誘導(dǎo)的OCR抑制。圖4E：在CPX治療后，DJ-1的過表達減弱CPX誘導(dǎo)的ECAR升高。
結(jié)論：DJ-1在CPX誘導(dǎo)的線粒體功能障礙中起重要作用。

五、CPX誘導(dǎo)CRC細胞自噬

藥理學(xué)調(diào)節(jié)自噬在癌癥治療中有巨大的潛在應(yīng)用。因此，研究CRC細胞中的自噬是否受CPX的調(diào)節(jié)，首先檢查了CPX處理的CRC細胞中自噬相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平。
圖5A：用指示濃度的CPX處理CRC細胞24小時后， LC3，ATG5，Beclin1和p62表達的免疫印跡分析。圖5B：20μM CPX為變量處理細胞24小時，通過免疫熒光分析顯示和定量內(nèi)源性LC3點的形成。圖5C：用透射電子顯微鏡在如(B)中所示處理的HCT116細胞中檢測自噬小泡。圖5D：左側(cè)，通過吖啶橙染色測定如(B)中所示處理的細胞自噬情況。右，每個細胞酸性囊泡細胞器(AVO)的總數(shù)。圖5E：來自載體或CPX處理的小鼠的HCT116異種移植物中LC3表達的IHC分析的代表性圖像。圖5F：用免疫印跡法檢測用載體或CPX處理的小鼠HCT116異種移植物中LC3的蛋白表達水平。
檢測了兩種自噬相關(guān)蛋白ATG5和Beclin 1的表達水平，以驗證CPX是否促進自噬小泡的形成。
如圖5A所示，CPX以劑量依賴的方式增強ATG5和Beclin 1的表達。此外，已有報道Beclin 1與Bcl-2相互作用的減弱是自噬啟動過程中的關(guān)鍵事件。圖5G：免疫共沉淀分析20μM CPX為變量處理24小時的大腸癌細胞中Beclin1和Bcl2之間的相互作用。
結(jié)論：CPX在體外和體內(nèi)都能誘導(dǎo)CRC細胞自噬。

六、CPX促進CRC細胞自噬通量

為了確定CPX是否誘導(dǎo)完全自噬通量，檢測自噬底物p62的蛋白質(zhì)水平。
如圖5A所示， CPX處理細胞中p62水平降低，同時LC3-II水平增加，這意味著誘導(dǎo)了完全自噬通量。圖6A：用載體、CPX(20μM)、CQ(10μM)或聯(lián)合作用24小時。免疫印跡法檢測LC3和p62的表達。圖6B：用CPX(20μM)、Baf A1(100 NM)處理CRC24小時。免疫印跡法檢測LC3和p62的表達。圖6C：用E64D(10μg/ml)和PepA(10μg/ml)在CPX(20μM)為變量的情況下處理CRC24小時。免疫印跡法檢測LC3和p62的表達。圖6D：用免疫熒光分析CQ(10μM)、Cpx(20μM)處理24小時后細胞的LC3點積聚情況。對LC3點的數(shù)量進行定量。圖6E：瞬時轉(zhuǎn)染串聯(lián) mRFP-GFP標(biāo)記的LC3并用載體、CPX(20μM)、CQ(10μM)或聯(lián)合處理24小時的細胞的免疫熒光分析。定量表示自溶酶體(GFP-/RFP+)的紅色斑點與表示自噬小體(GFP+/RFP+)的黃色斑點的比率。圖6F：免疫熒光分析內(nèi)源性LC3和LAMP1在經(jīng)載體、CPX(20μM)、CQ(10μM)或聯(lián)合處理24小時后在CRC中的共定位。
結(jié)論：CPX在CRC細胞中誘導(dǎo)了完全自噬通量。

七、抑制自噬增強CPX的抗CRC作用

為了評估自噬是否參與了CPX的抗CRC作用，用CPX和自噬抑制劑CQ聯(lián)合處理CRC細胞。
圖7A&B：以10μM CQ為變量，用CCK8比色法檢測指示濃度的CPX處理CRC24小時后的細胞存活率。圖7C：用CCK8比色法檢測轉(zhuǎn)染siNC或siATG5 24小時后再以20μM CPX為變量處理24小時的CRC細胞的細胞存活率。圖7D：20μMCPX、10μM CQ處理24h后的大腸癌細胞的EDU測定。對EDU摻入進行定量。圖7E&F：HCT116細胞和SW480細胞以10μM CQ為變量的情況下用指定濃度的CPX處理。菌落形成實驗檢測細胞增殖情況。圖7G：用siNC或siATG5轉(zhuǎn)染大腸癌細胞24小時，然后以20μM CPX為變量再處理24小時。固定細胞，Annexin V/PI染色，流式細胞儀分析。對細胞凋亡的發(fā)展進行定量。
結(jié)論：抑制自噬增強CPX的抗CRC作用。

八、RUNX1對DJ-1的轉(zhuǎn)錄抑制作用

CPX處理明顯抑制DJ-1mRNA的表達(圖2B)。為了探索DJ-1是否在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，在HCT116和SW480細胞中使用轉(zhuǎn)錄組測序分析CPX處理下轉(zhuǎn)錄因子的表達。圖8A：在HCT116 Ctrl VS CPX和SW480 Ctrl VS CPX之間進行轉(zhuǎn)錄因子的Venn圖分析。圖8B：以20μM CPX為變量處理的HCT116和SW480細胞中與DJ-1啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的歸一化強度值的熱圖表示。圖8C：在HCT116和SW480細胞中進行qRT-PCR，以確定(B)中基因的mRNA水平。
為了驗證這些轉(zhuǎn)錄因子中的哪些介導(dǎo)了DJ-1的抑制，干擾那些使用特定siRNA的轉(zhuǎn)錄因子。
圖8D：將siRUNX1轉(zhuǎn)染HCT116細胞24小時，然后以20μM CPX為變量處理24小時。免疫印跡法檢測DJ-1蛋白水平。圖8E：用siNC或siRUNX1轉(zhuǎn)染HCT116細胞24h，qRT-PCR檢測DJ-1和RUNX1mRNA的表達。圖8F：免疫印跡分析瞬時轉(zhuǎn)染載體或FLAG-RUNX1質(zhì)粒24小時后然后以20μM CPX為變量再處理24小時DJ-1和RUNX1在HCT116細胞中的表達。圖8G：在以20μM CPX為變量的情況下，瞬時轉(zhuǎn)染載體或Flag-RUNX1質(zhì)粒的HCT116細胞中DJ-1啟動子的熒光素酶報告研究。
為了研究RUNX1是否直接結(jié)合到DJ-1啟動子上，用染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)法檢測RUNX1是否與DJ-1啟動子結(jié)合。
圖8H：將轉(zhuǎn)染RUNX1質(zhì)粒48小時的HCT116細胞染色質(zhì)與RUNX1抗體進行芯片分析，然后用qRT-PCR擴增DJ-1啟動子的不同RUNX1結(jié)合位點區(qū)域。相對于IgG計算富集量。
結(jié)論：CPX誘導(dǎo)的DJ-1抑制在很大程度上是由于RUNX1的上調(diào)，RUNX1通過直接與其啟動子結(jié)合來轉(zhuǎn)錄抑制DJ-1。