新發(fā)現(xiàn)：circTP63作為競爭性內(nèi)源RNA通過上調(diào)FOXM1表達(dá)而促進(jìn)肺鱗癌的發(fā)生

   非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要組織學(xué)類型，約占80-85%，其中肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）是主要的亞型，最近，針對特定基因突變的靶向藥物的開發(fā)極大地改善了晚期LUAD患者的治療，，由于鉑類化療對LUSC的療效降低所致，一小部分的LUSC港驅(qū)動基因突變，導(dǎo)致5年生存率低于5%。因此深入探索LUSC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找治療LUSC的潛在分子靶點(diǎn)變得尤為重要。近年來，circRNA作為一種新型的調(diào)控RNA分子，引起了廣泛的關(guān)注，隨著對其結(jié)構(gòu)和功能深入認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)circRNA在人類疾?。▌用}粥樣硬化血管疾病、神經(jīng)疾病、心臟病和癌癥）等疾病中起重要作用。circRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）在多種類型癌癥中發(fā)揮功能，在肺癌中，LUAD相關(guān)的circRNAs被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但是，尚未全面探討circRNA在LUSC中的作用和機(jī)制。
    7月份，覃文新研究員課題組與姜麗巖教授團(tuán)隊(duì)合作發(fā)表一篇“circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.”的SCI文章，IF= 11.878。該研究在五個LUSC病人標(biāo)本中研究了circRNA和mRNA的表達(dá)譜，鑒定circTP63在LUSC中顯著上調(diào)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)circTP63與LUSC病人的腫瘤大小和TNM分期呈正相關(guān)，而且體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)表明circRNA過表達(dá)促進(jìn)LUSC細(xì)胞的周期進(jìn)程和增殖。機(jī)制上，發(fā)現(xiàn)circRNA充當(dāng)ceRNA來上調(diào)FOXM1來促進(jìn)細(xì)胞增殖，競爭性結(jié)合miR-873-3p，進(jìn)而破壞miR-873-3p對其靶基因FOXM1的抑制作用，從而FOXM1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)其下游分子CENPA和CENPB的表達(dá)，最終影響細(xì)胞周期和增殖。簡言之，該研究首次發(fā)現(xiàn)circTP63 通過ceRNA的機(jī)制驅(qū)動LUSC的發(fā)生發(fā)展，為LUSC的治療提供了新策略。
技術(shù)路線：

一、篩選肺鱗癌關(guān)鍵環(huán)狀RNA分子-circTP63
   通過q-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circTP63在肺鱗癌組織中明顯上調(diào)，而且circTP63的表達(dá)與TB63表達(dá)呈正相關(guān)。顯然circTP63在LUSC中上調(diào)，重要的是， circTP63在LUSC組織與LUSC患者腫瘤較大小和更高的TNM分期呈正相關(guān)，并且其調(diào)節(jié)與以后的臨床階段相關(guān)。

二、肺鱗癌細(xì)胞中circTP63的鑒定
   circTP63來自TP63基因的外顯子10至11，長度為295 nt。Northern印跡實(shí)驗(yàn)證明circTP63在295nt位置。circTP63轉(zhuǎn)錄本的半衰期超過24小時，比TP63更穩(wěn)定（圖  2d）。circTP63轉(zhuǎn)錄本偏好在細(xì)胞質(zhì)中（圖  2e）。在六個LUSC細(xì)胞系和兩個人類正常肺細(xì)胞系中的內(nèi)源性circTP63表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)circTP63在LUSC細(xì)胞系中上調(diào)相比于人正常肺細(xì)胞系（補(bǔ)充圖  3a）。基于此結(jié)果，選擇SW900和H1703細(xì)胞用于circTP63功能喪失檢測，而選擇H226和H2170細(xì)胞進(jìn)行功能增益檢測。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了circTP63作為circRNA 的特征。

三、體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)證明circTP63促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。
   A和b. circTP63基因沉默后與過表達(dá)后qRT-PCR表明TP63的表達(dá)不受circTP63的影響；c和d. circTP63沉默或過表達(dá)后表明circTP63促進(jìn)細(xì)胞增殖；e和f. circTP63沉默或過表達(dá)后表明促進(jìn)細(xì)胞周期；g和h. circTP63沉默和過表達(dá)后表明circTP63增加腫瘤體積和重量。這些發(fā)現(xiàn)表明， circTP63可能在體外和體內(nèi)在LUSC中發(fā)揮致癌作用。

四、circTP63在肺鱗癌中的分子機(jī)制。
   A和B.circTP63和mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)了25個潛在的mRNA參與肺鱗癌的發(fā)展，其circTP63中FOXM1，KIFI8B和BRCA1是預(yù)測前三共表達(dá)的mRNA，而且在LUSC中FOXM1是明顯上調(diào)8倍多。C.進(jìn)一步確認(rèn)了上調(diào)水平35個配對LUSC樣品中的FOXM1的表達(dá)。D. 與KIF18B或BRCA1相比，circTP63的表達(dá)與FOXM1正相關(guān).E. OXM1的八個成對LUSC樣品的蛋白水平，然后用的轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性的分析circTP63表明，F(xiàn)OXM1在LUSC組織顯著上調(diào)并與正相關(guān)circTP63。F.通過qRT-PCR和Western blots驗(yàn)證了circTP63沉默明顯降低FOXM1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，同時FOXM1沉默和過表達(dá)明顯影響細(xì)胞的生長和細(xì)胞的周期發(fā)展，因此作者說明circTP63可能通過靶向FOXM1調(diào)控LUSC細(xì)胞的增殖。

五、circTP63調(diào)控FOXM1的表達(dá)。
   作者通過生信分析構(gòu)建circTP63-miRNAs-FOXM1網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)circTP63和FOXM1的共同結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步證實(shí)circTP63可以作為ceRNA來調(diào)節(jié)FOXM1的表達(dá)，我們通過拷貝數(shù)測量了LUSC細(xì)胞系中circTP63和miR-873-3p的絕對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在大多數(shù)測試的LUSC細(xì)胞系中，circTP63的絕對表達(dá)量遠(yuǎn)高于miR-873-3p（補(bǔ)充圖  6d），這表明circTP63對海綿miR-873-3p是合理的。然后，我們使用生物素偶聯(lián)的miR-873-3p模擬物進(jìn)行了下拉實(shí)驗(yàn)，以檢測circTP63和FOXM1的競爭結(jié)合活性到的miR-873-3p在H2170細(xì)胞。我們注意到，的近三倍富集circTP63和的近6倍富集FOXM1在的miR-873-3p捕獲分?jǐn)?shù)與陰性對照相比熒光酶實(shí)驗(yàn)分析表明miR-873-3p顯著性降低circTP63的熒光活性表達(dá)，并且RIP也顯示下拉的分子中富含大量的circTP63。利用RNA pull down驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)circTP63和FOXM1復(fù)合物富集大量的miR-873-3p，過表達(dá)miR-873-3p同系物顯著降低circTP63和FOXM1熒光素酶活性。circTP63充當(dāng)ceRNA吸附miR-873-3p上調(diào)FOXM1的表達(dá)，影響肺鱗癌發(fā)展。

六、circTP63促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的周期發(fā)展。
   FOXM1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器，控制細(xì)胞從G1期到S期以及到M期轉(zhuǎn)變的過程。作者選擇了FOXM1可能的8個下游靶基因，通過q-PCR檢測到circTP63過表達(dá)時CENPA、CENPB和CCNB1顯著性上調(diào)，回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和表型實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了CENPA和CCNPB能夠影響細(xì)胞的增殖。