eccDNA——科研最新熱點(diǎn)

    近期，Nature與Cell相繼發(fā)表文章討論染色體外環(huán)狀DNA（eccDNA）。人體有基因組，包括22對(duì)常染色體和1對(duì)性染色體。 國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校Ludwig癌癥研究所的Paul Mischel教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，大量的癌基因并不在染色體上，而是會(huì)從染色體上脫落下來(lái)，變成一種小型的DNA，稱(chēng)為染色體外DNA（ecDNA），后被驗(yàn)證染色體外DNA為環(huán)狀，因此也稱(chēng)為染色體外環(huán)狀DNA (eccDNAs)。EccDNA在許多類(lèi)型的癌癥中很常見(jiàn)，它們由染色體基因形成并促進(jìn)腫瘤發(fā)生。癌癥患者血液的篩查顯示，血漿中也可發(fā)現(xiàn)<2 kb eccDNA。在肺癌患者健康的肺組織中發(fā)現(xiàn)<2 kb eccDNAs，這表明eccDNA從惡性組織遷移或在健康組織中形成。
    健康供體的血漿中eccDNA進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果高達(dá)20 kb。 作者假設(shè)健康組織還包含較大的eccDNA，其大小足以包含一個(gè)或幾個(gè)全長(zhǎng)基因，原因 (1) 在人類(lèi)腫瘤中發(fā)現(xiàn)大于100kb的eccDNA，最有可能是由隨機(jī)突變過(guò)程引起的，有望從基因組的所有部分形成eccDNA； (2)已知缺失會(huì)在酵母和牛中產(chǎn)生eccDNA。 (3)體細(xì)胞中的缺失大小可達(dá)6Mb。

發(fā)表期刊：Nature Communication影響因子：11.878實(shí)驗(yàn)方法: eccDNA-seq RNA-seq
技術(shù)路線(xiàn):

一、健康男性中全基因組eccDNA的全基因組檢測(cè)
    eccDNA測(cè)序結(jié)果充分體現(xiàn)了基因組水平成環(huán)的多樣性。eccDNA來(lái)源十分豐富，同一個(gè)基因有可能會(huì)產(chǎn)生非常多的環(huán)狀，同樣一個(gè)環(huán)狀也不僅僅只會(huì)包含一個(gè)外顯子。TTN基因就是一個(gè)非常典型的例子。該基因長(zhǎng)度達(dá)到了0.3Mb，而這樣一個(gè)基因竟然能衍生得到130個(gè)eccDNA，是一個(gè)經(jīng)典的編碼基因區(qū)域成環(huán)的案例。其中比較有代表性的是43-66以及44-52號(hào)外顯子所組成的環(huán)狀分子。eccDNA測(cè)序的目的正是在組學(xué)的層面上全面的描述刻畫(huà)eccDNA的成環(huán)多種可能性。

                                                                           圖1 來(lái)源于TNN基因的兩例eccDNA

二、EccDNA的數(shù)量和大小
    從16個(gè)肌肉樣品中鑒定出10萬(wàn)多種不同的eccDNA(n = 138,027)(補(bǔ)充圖1c-e)。所有染色體均以eccDNA序列表示，其總長(zhǎng)度為人類(lèi)基因組的12.6％(389.5 Mb)。帶有高度自信（高置信度的）的EccDNA大小從0.05μkb到57.8μkb不等，在0.1μkb和5μkb處有兩個(gè)明顯的峰(圖2a,b)。然而，鑒于較寬的conf間隔，使用當(dāng)前樣本量可能會(huì)忽略不活躍和活躍男性的eccDNA計(jì)數(shù)之間的顯著差異(圖2a，b)。我們發(fā)現(xiàn)每100個(gè)白細(xì)胞核中有3.5-5.6個(gè)不同的eccDNA，而肌肉組織中每100個(gè)核中有0.85-0.93個(gè)不同的eccDNA。

                                                                         圖2 eccDNA長(zhǎng)度分布和來(lái)源多樣性

三、eccDNA基因組分布
    多數(shù)eccDNA(99％)小于25 kb(圖2a，b，圖3a，補(bǔ)充圖3a，b;補(bǔ)充圖4)，而其余1％來(lái)自斷點(diǎn)，相距大于25 kb (圖3b)。所有eccDNA的一半以上來(lái)自基因或假基因區(qū)域(血液55％，組織52％)。例如，樣品T8中的11.1kb [S100A3-S100A4circle 153,512-153,523kb]包括S100A3和S100A4的完整基因以及S100A5的部分基因。 S100A4編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起因果作用。

                                                                              圖3 eccDNA的染色體分布

四、eccDNA成環(huán)驗(yàn)證
    eccDNA的形成與經(jīng)典的circRNA具有相似性，也是經(jīng)過(guò)核酸序列的反式鏈接得到的產(chǎn)物。對(duì)于環(huán)狀的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證可以模仿circRNA，針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，就是鏈接位點(diǎn)設(shè)計(jì)發(fā)散引物和收斂引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)Sanger測(cè)序的方式驗(yàn)證eccDNA的接頭序列。

                                                                            圖4 EccDNA驗(yàn)證和DNA缺失

五、染色體17和19的成環(huán)可能性較大
    eccDNA的基因組分布表明，富基因的染色體17和19比每條Mb分別使eccDNA的平均頻率分別高1.7倍和2.9倍。

                                                            圖5 EccDNA相對(duì)于染色體的頻率，基因密度和轉(zhuǎn)錄

六、eccDNA具有轉(zhuǎn)錄活性
    轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)表明，至少有一部分eccDNA存在于細(xì)胞核中，并沒(méi)有被隔離在組織的轉(zhuǎn)錄無(wú)活性的區(qū)室中。 eccDNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步排除了檢測(cè)到的eccDNA僅僅是細(xì)胞凋亡驅(qū)動(dòng)的片段化的副產(chǎn)物的可能性，如對(duì)于<2-kb eccDNA(microDNA)44所建議的那樣，或者是在eccDNA純化過(guò)程中產(chǎn)生的。

                                                                 圖6 HIP1形成eccDNA具有轉(zhuǎn)錄活性
結(jié)論:
    （1） eccDNA在健康人組織和血液中很常見(jiàn)，其大小足以攜帶一個(gè)或幾個(gè)完整基因。
    （2）eccDNA由介于0.05—999.8 kb之間的染色體斷點(diǎn)形成。eccDNA具有轉(zhuǎn)錄活性，并且eccDNA通過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)或截短的基因來(lái)促進(jìn)表型變異。
    （3）表型變異復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的無(wú)中心的eccDNA對(duì)細(xì)胞影響重大，因?yàn)橛薪z分裂中的錯(cuò)分會(huì)產(chǎn)生可變的eccDNA拷貝數(shù)。
參考文獻(xiàn)：
    M Ller H D , Mohiyuddin M , Prada-Luengo I , et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):1069.