腫瘤轉移新機制：外泌體PMK2影響轉移前微環(huán)境

    早中期前列腺癌（PCa）的預后還比較可觀，但是晚期的PCa預后較差，五年總體生存率較低，尤其是轉移性PCa的死亡率較高。然而，PCa選擇性骨轉移的機制尚未可知。本文子在研究背景下出發(fā)發(fā)現(xiàn)了一種外泌體介導的PCa選擇性骨轉移的作用機制，并于2019年12月發(fā)表在期刊journal of experimental medicine (IF: 10.892)上。
主要結果如下：
1、前列腺癌來源的外泌體促進小鼠骨腫瘤的生長
    從PC3細胞系分離得到的外泌體如圖1所示。

                                                                      圖1 外泌體的分離與鑒定
    使用上述外泌體注射小鼠左心室21天，圖2A和B顯示PCa來源外泌體處理組的腫瘤負荷和轉移部分都顯著高于對照組、健康組和無外泌體處理組。并且，經外泌體預處理后的骨髓細胞中能檢測到更多的前列腺癌細胞（圖2 C）。靜脈注射GFP標記的PCa來源外泌體，24小時后在骨髓基質干細胞檢測的熒光圖片（圖2 D）。前列腺原位注射GFP標記的PCa來源外泌體，21天后在骨髓基質干細胞檢測的熒光圖片（圖2 E）。此外，檢測了其它組織中是否有前列腺癌細胞的的轉移，結果如預期，在骨髓中轉移最多（圖2 G）。以上說明PCa外泌體并不直接作用于PCa細胞，而是通過遠端靶微環(huán)境間接靶向和促進PCa進展，對骨髓有靶向選擇性。

                                                               圖2前列腺癌來源的外泌體促進小鼠骨腫瘤的生長

2、前列腺癌來源的外泌體可以誘導骨基質細胞增加PCa腫瘤細胞的增殖和侵襲
    為了研究外泌體是否通過微環(huán)境間接促進PCa進展，我們評估了外泌體改變BMSCs影響PCa細胞生長能力的程度。分別使用新鮮培養(yǎng)基、C4-2B細胞外泌體、ST2細胞條件培養(yǎng)基、C4-2B細胞外泌體處理ST2細胞48小時后的條件培養(yǎng)基處理PC3和LNCaP細胞，結果發(fā)現(xiàn)未經外泌體處理的培養(yǎng)基并不能促進PCa細胞生長，相反，外泌體預處理后的基質細胞培養(yǎng)基可以促進PCa細胞生長（圖3A）。因此，作者推測，外泌體通過改變基質細胞來促進PCa細胞生長。
    為進一步驗證上述推測，將PCa細胞皮下移植到沒有基質細胞或相反側腹有基質細胞的膠原海綿上，然后用空載體或PCa外泌體處理小鼠。單獨的外泌體和基質細胞均不影響PCa的生長，而在基質細胞負載的海綿中，外泌體誘導了PCa的生長(圖3B)。這些結果為體內外泌體調節(jié)基質細胞促進PCa生長提供了證據(jù)。為確定外泌體介導的對基質細胞的影響是否只針對成纖維細胞間質或擴展到其他骨髓細胞成分研究了PCa外泌體對內皮細胞、成骨細胞和破骨細胞前體細胞調節(jié)PCa生長能力的影響，結果顯示，外泌體對成纖維細胞間質細胞的作用最強，其次是成骨細胞，對內皮細胞或破骨細胞無影響(圖3C)。為了確定外泌體介導的基質細胞調節(jié)是否擴展到PCa進展的其他方面，評估了它們對PCa細胞侵襲性的影響，基質細胞條件培養(yǎng)基單獨作用可促進PCa的侵襲，然而，經PCa細胞外泌體預處理的基質細胞的條件培養(yǎng)基進一步增強了PCa細胞的侵襲能力(圖3 D)。

                                                     圖3 PCa來源的外泌體可以誘導骨基質細胞增加PCa腫瘤細胞的增殖和侵襲
    以上結果均是使用小鼠間質細胞系，作者進一步探究了是否在人的基質細胞系中也有相同的作用。因此，重復幾次使用HS-5人骨髓干細胞系的實驗，得出了類似的結論，如圖4所示。這些結果表明，來源于PCa的外泌體對骨髓基質的影響能夠促進PCa的進展。

                                                  圖4 PCa來源外泌體培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞增加PCa腫瘤細胞的增殖和侵襲

3、PCa來源外泌體增加了基質細胞中PKM2的表達和C-X-C基序趨化配體12 (CXCL12)的產生
    為了探索外泌體誘導骨髓基質形成腫瘤表型的機制，進行了蛋白組測序，在未處理細胞和外泌體處理細胞中篩選到超過30個差異表達蛋白。其中PKM2的差異最為顯著，并且它是一種關鍵的生物學功能調節(jié)酶。因此，以PKM2為研究目標。研究發(fā)現(xiàn)，PCa外泌體可以增加患者和細胞系中PKM2在ST2細胞和原代BMSC中的表達水平(圖5 A-C)。這說明，外泌體不誘導PKM2 mRNA的轉錄而是將PKM2蛋白從外泌體轉移到靶細胞并/或內源性誘導PKM2向基質細胞轉移。為了確定外泌體是否在基質細胞中誘導PKM2蛋白的合成，使用蛋白合成抑制劑CHX處理基質細胞。在有或沒有CHX的情況下，PCa來源的外泌體誘導基質細胞來源的外泌體中的PKM2水平達到類似的水平(圖5 D)，表明這種增加并不依賴于蛋白質的合成。為了進一步證明PKM2是從人類PCa細胞轉移到小鼠間質細胞，使用針對人類而非小鼠PKM2的抗體評估了PKM2在間質細胞中的表達。用含有人PKM2的外泌體處理基質細胞(爭奪對照)可增加人PKM2在基質細胞中的表達(圖5 E)。綜上所述，這些結果表明外泌體將PKM2蛋白轉移到基質細胞，而不是誘導PKM2 mRNA合成或蛋白合成。

                                                              圖5 PCa來源的外泌體將PKM2蛋白轉移到BMSCs
    之后，探究PKM2是否是外泌體介導基質細胞促進PCa細胞轉移的關鍵。作者在PCa細胞中敲低PKM2以創(chuàng)建PKM2缺陷型外泌體，并測試其誘導促腫瘤發(fā)展的能力。圖6A證實敲低PKM2會導致產生缺乏PKM2的外泌體（圖6A）。進一步地，PKM2缺失的外泌體沒有改變ST2基質細胞中PKM2蛋白的表達(圖6B)。上述表明PKM2蛋白是轉移到基質細胞，而不是由外泌體誘導合成。為了確定PKM2的缺失是否會影響腫瘤生長，將PKM2缺失的外泌體處理的基質細胞培養(yǎng)成條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)癌細胞系，導致PCa外泌體誘導PCa細胞生長能力的喪失(圖6 C)。小鼠體內實驗證實原發(fā)前列腺腫瘤促進轉移，PKM2促進原發(fā)腫瘤的轉移能力。這些結果與原發(fā)腫瘤可以通過外泌體PKM2促進轉移的觀點相一致。

                                                         圖6 PCa來源的外泌體通過PKM2增加基質細胞中CXCL12的產生

4、PCa外泌體通過PKM2誘導的BMSCs分泌CXCL12促進PCa腫瘤生長
    為了探索PCa外泌體中的PKM2是否通過調節(jié)基質細胞中可溶性因子的產生以促進PCa的生長，使用qPCR陣列評估經對照或PKM2敲除PCa外泌體的基質細胞產生趨化因子和細胞因子的表達量。PKM2的下調改變了幾種細胞因子的表達，BMP-4和CXCL12的表達下降最為明顯(圖7A)。實驗發(fā)現(xiàn)，PKM2敲除后對CXCL12的表達影響要遠大于BMP-4（圖7B-C）?？傊?，PKM2顯著增加基質細胞中CXCL12的產生，而對BMP-4的誘導作用有限。

                                                        圖7 外泌體PKM-2促進骨髓基質BMP-4和CXCL12的表達
    為了確定PCa外泌體誘導的基質細胞是否通過CXCL12促進PCa細胞生長，有或沒有AMD3100（一種抑制CXCL12結合其靶標CXCR4的物質）的條件下，用PCa外泌體處理的基質細胞的條件培養(yǎng)基中孵育PCa細胞。如前觀察到的，來自PCa衍生的外來體處理過的基質細胞的條件培養(yǎng)基增加了PC3和C4-2B細胞的生長和侵襲。但是，AMD3100抑制了這種誘導作用（圖8A和B）。這表明CXCL12有助于外泌體誘導的增殖作用。并驗證了CXCL12促進PCa細胞增殖與侵襲依賴于PKM2。但是，與僅使用PKM2敲除的PCa外泌體相比，AMD3100和PKM2敲除的PCa外泌體的組合作用并沒有進一步抑制增殖或侵襲（圖8C和D）。如圖8E-L所示，在小鼠體內實驗中也驗證了上述結論。綜上所述，PCa外泌體運輸?shù)腜KM2調節(jié)基質細胞中CXCL12的產生以促進PCa的生長和侵襲。

                                            圖8 PCa外泌體通過PKM2誘導的骨髓細胞CXCL12表達促進PCa腫瘤生長

5、PCa外泌體通過PKM2依賴方式誘導HIF-1α促進基質細胞中CXCL12表達
    文獻報道HIF-1α促進CXCL12的表達，因此，作者首先探究了外泌體是否促進HIF-1α表達又是否依賴于PKM2。結果顯示PCa來源的外泌體刺激了ST2基質細胞系和BMSC中HIF-1α mRNA和蛋白水平的表達，在PKM2敲除的PCa外泌體顯著減少了HIF-1α mRNA和蛋白表達(圖9A-C)。這些結果表明，PCa衍生的外來體以PKM2依賴的方式促進HIF-1α表達。為了確定外泌體誘導的HIF-1α是否調節(jié)CXCL12表達，敲低基質細胞中的HIF-1α，并用外泌體處理，以確認HIF-1α表達的喪失（圖9 D）。然后，用C4-2B PCa衍生的外泌體處理基質細胞，并觀察到基質細胞中HIF-1α的敲低顯著降低了外泌體介導的CXCL12 mRNA和蛋白的表達（圖9 E）。綜上所述，PCa衍生的外泌體以PKM2依賴性方式刺激HIF-1α表達，進而誘導CXCL12表達。

                                           圖9 PCa來源的外泌體增加BMSC細胞中CXCL12表達通過PKM2誘導HIF-1α
綜上所述，本文證實，腫瘤來源的外泌體介導的PKM2轉移是調節(jié)骨髓微環(huán)境以促進CXCL12表達和PCa骨轉移進展的關鍵介質?？偟膩碚f，這項工作提出了一種新穎的機制，通過該機制，原發(fā)性腫瘤與骨骼微環(huán)境發(fā)生相互作用，從而建立了轉移前niche環(huán)境并促進PCa骨轉移進程。
參考文獻：
    Dai Jinlu., Escara-Wilke June., Keller Jill M., Jung Younghun., Taichman Russell S., Pienta Kenneth J., Keller Evan T.(2019). Primary prostate cancer educates bone stroma through exosomal pyruvate kinase M2 to promote bone metastasis. J. Exp. Med., 216(12), 2883-2899. doi:10.1084/jem.20190158