缺氧誘導(dǎo)的lncRNA-AC020978促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和糖酵解代謝

    非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是一種以代謝異常為特征的致死性疾病。糖酵解相關(guān)的lncRNA在NSCLC侵襲行為中的作用機(jī)制尚不清楚。因此小編為大家詳細(xì)介紹發(fā)表于“Theranostics”上的文章“Hypoxia-induced lncRNA-AC020978 promotes proliferation and glycolytic metabolism of non-small cell lung cancer by regulating PKM2/HIF-1α axis”，讓大家了解lncRNA-AC020978促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和糖酵解代謝的分子機(jī)制。

    在本研究中，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR和熒光原位雜交技術(shù)檢測AC020978在NSCLC中的表達(dá)水平。通過體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，研究了AC020978在細(xì)胞增殖和有氧糖酵解中的生物學(xué)作用。采用雙熒光素酶報(bào)告基因、染色質(zhì)免疫沉淀法檢、RNA下拉法等實(shí)驗(yàn)方法研究了AC020978的分子機(jī)制。
結(jié)果：
1.AC020978在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義
    為了探討AC020978在腫瘤中的臨床意義，我們對NSCLC及其鄰近組織進(jìn)行了FISH檢測。如圖1A和1D所示，AC020978在腫瘤組織中過表達(dá)，在鄰近的非腫瘤組織中很少表達(dá)。此外，AC020978的表達(dá)隨著TNM的進(jìn)展而增加（圖1B，1E）。Kaplan-Meier分析顯示AC020978的高表達(dá)與這些患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)（P<0.01，圖1C）。
    為進(jìn)一步評價(jià)AC020978的病理和臨床預(yù)測價(jià)值，對AC020978、TNM和AC020978與TNM聯(lián)合應(yīng)用組進(jìn)行ROC分析。AUC數(shù)據(jù)顯示，聯(lián)合模型高于單用TNM模型（圖1F）。隨后，我們發(fā)現(xiàn)AC020978表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)（圖1G）?？傊?，這些結(jié)果提示AC020978可能是NSCLC的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

2.AC020978是NSCLC細(xì)胞中的一種致癌lncRNA
    為了闡明AC020978在細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用，我們用兩種不同的siRNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞。Si-0978#1對AC020978的抑制作用最強(qiáng)。qRT-PCR證實(shí)AC020978的表達(dá)可增加1000倍以上（圖2A）。
    為探討AC020978在NSCLC進(jìn)展中的生物學(xué)作用，采用CCK-8、EdU染色、集落形成分析等方法對細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究。結(jié)果表明在A549和H1299細(xì)胞中，AC020978基因敲除后，細(xì)胞增殖顯著減弱。此外，重新表達(dá)AC020978可以挽救減弱的細(xì)胞增殖率（圖2B-C）。在功能增益分析中，AC020978的過表達(dá)加速了H1299細(xì)胞的增殖效應(yīng)（圖2E-2F）。采用Transwell法檢測AC020978在NSCLC細(xì)胞中的遷移能力。結(jié)果表明，AC020978異位表達(dá)的H1299細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，而AC020978的下調(diào)與陰性對照相比抑制了A549和H1299細(xì)胞的遷移活性，而AC020978在穩(wěn)定的AC020978敲除細(xì)胞中的重新表達(dá)可以挽救減弱的細(xì)胞遷移（圖2D和2G）。

3.AC020978是在代謝應(yīng)激下誘導(dǎo)的，是糖酵解代謝重編程的關(guān)鍵
    為了闡明AC020978在代謝應(yīng)激下是否對細(xì)胞存活起作用，我們采用2.5mM到25mM的葡萄糖濃度梯度模擬葡萄糖剝奪條件。如圖3A-3D所示，AC020978是由葡萄糖剝奪或2-DG治療以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)的，表明AC020978可能在細(xì)胞對代謝應(yīng)激的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
    其次，檢測AC020978是否直接影響葡萄糖代謝。如圖3E和3F所示，AC020978的沉默提高了最大呼吸強(qiáng)度， AC020978的敲除明顯降低了A549細(xì)胞的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲備。相比之下，AC020978的過表達(dá)在H1299細(xì)胞中表現(xiàn)出相反的代謝通量（圖3G和3H），表明AC020978促進(jìn)了糖酵解途徑。此外，AC020978下調(diào)的A549細(xì)胞18F-FDG攝取和乳酸生成顯著減少，而在H1299細(xì)胞中異位誘導(dǎo)的AC020978表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)作用（圖3I-J）。此外，我們還測量了幾種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的蛋白質(zhì)水平。Western blotting結(jié)果顯示，AC020978表達(dá)的改變對它們有積極影響（圖3K）。這些數(shù)據(jù)表明AC020978是一種葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的lncRNA，可以調(diào)節(jié)NSCLC的糖酵解代謝。
    由于HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)缺氧和低葡萄糖供應(yīng)的重要基因，因此在葡萄糖饑餓條件下分析了HIF-1α的蛋白水平和反式激活（圖3L）。結(jié)果表明，HIF-1α和HIF-1α響應(yīng)的熒光素酶報(bào)告均受低葡萄糖誘導(dǎo)。有趣的是，與較長的供應(yīng)相比，24小時(shí)的HIF-1α蛋白表達(dá)最高，而48小時(shí)的HIF-1α響應(yīng)性熒光素酶活性最高，這表明癌細(xì)胞可能不斷適應(yīng)其代謝應(yīng)激微環(huán)境。

4.AC020978促進(jìn)腫瘤生長和體內(nèi)有氧糖酵解
    為了探討AC020978在體內(nèi)的作用，我們建立了AC020978基因敲除的A549細(xì)胞系，并建立異種移植模型。如圖4A-B和4D所示，與對照組相比，AC020978基因敲除顯著降低了腫瘤體積和腫瘤重量。此外，來自對照組的異種移植體具有相對較強(qiáng)的18F-FDG積累，而AC020978下調(diào)組的18F-FDG攝取量要低得多（圖4C-4E）。異種移植組織的IHC染色表明AC020978介導(dǎo)腫瘤生長和糖酵解（圖4F-4G）?？傊?，這些結(jié)果表明AC020978在促進(jìn)NSCLC增殖和糖酵解方面發(fā)揮了重要作用。

5.AC020978是缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α直接反式激活因子
    我們探討了導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌AC020978高表達(dá)的原因。利用啟動子序列分析工具對編碼AC020978基因進(jìn)行了檢測。在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)假定的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)（圖5D）。缺氧或其化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2處理24小時(shí)后，A549和H1299細(xì)胞中AC020978的表達(dá)明顯升高，與HIF-1α表達(dá)上調(diào)一致（圖5A）。相反，HIF-1α基因敲除顯著抑制AC020978在常氧和缺氧條件下的表達(dá)（圖5B-5C）。另外，ChIP-qPCR分析表明HIF-1α直接與AC020978基因兩個(gè)預(yù)測啟動子區(qū)的染色質(zhì)片段結(jié)合（圖5G）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α對AC020978轉(zhuǎn)錄的激活作用，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。與預(yù)期的一樣，在含有野生型啟動子（WT）的細(xì)胞中，缺氧顯著提高了熒光素酶的密度。然而，HIF-1α的敲除顯著抑制了含有WT啟動子的熒光素酶密度（圖5E-F，H-5I）。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明AC020978是HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。

6.AC020978與PKM2物理結(jié)合并介導(dǎo)PKM2蛋白的穩(wěn)定性
    我們進(jìn)行RNA下拉和質(zhì)譜分析篩選AC020978相互作用蛋白，如圖6A所示。 RIP分析結(jié)果表明，在PKM2免疫復(fù)合物中，AC020978共沉淀有一個(gè)穩(wěn)定而特異的富集（圖6B）。RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKM2蛋白特異性地與AC020978的序列結(jié)合（圖6C）。
    接下來，我們嘗試探索這種AC020978-PKM2相互作用的分子功能。我們發(fā)現(xiàn)AC020978表達(dá)的改變調(diào)節(jié)了PKM2蛋白水平（圖6D）因此，我們推測AC020978可能調(diào)節(jié)PKM2蛋白的穩(wěn)定性。我們觀察到，通過在A549細(xì)胞中添加MG-132，明顯恢復(fù)了通過AC020978下調(diào)而降低的PKM2蛋白水平（圖6E）。環(huán)己酰亞胺（CHX）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AC020978下調(diào)細(xì)胞中PKM2的半衰期較短，而AC020978高表達(dá)細(xì)胞中PKM2的半衰期較長（圖6F），提示AC020978對PKM2的調(diào)控可能是通過抑制蛋白酶體降解來實(shí)現(xiàn)的。
    最后，我們通過體外泛素化試驗(yàn)檢測了AC020978是否參與了泛素介導(dǎo)的PKM2降解。下調(diào)AC020978可提高A549細(xì)胞PKM2蛋白泛素化水平。泛素介導(dǎo)的PKM2的降解作用在AC020978高表達(dá)H1299細(xì)胞中被顯著抑制（圖6G）。這些結(jié)果表明，AC020978通過泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解有助于維持PKM2蛋白的穩(wěn)定性。

7.AC020978促進(jìn)PKM2的核移位并調(diào)節(jié)PKM2增強(qiáng)的HIF-1α反式激活活性   
    免疫熒光染色顯示，AC020978可調(diào)節(jié)PKM2的表達(dá)。在A549陰性對照細(xì)胞中，PKM2主要存在于胞漿中。而在AC020978敲除細(xì)胞中，幾乎看不到任何可檢測到的核PKM2。當(dāng)比較AC020978高表達(dá)細(xì)胞中PKM2的細(xì)胞分布時(shí)，可以看到核PKM2水平的增加（圖6H）。對A549和H1299細(xì)胞核質(zhì)和胞質(zhì)組分的Western blotting分析表明，PKM2主要在胞質(zhì)組分中表達(dá)。A549細(xì)胞沉默AC020978后，PKM2的細(xì)胞核和胞漿部分信號降低。然而，根據(jù)免疫熒光結(jié)果（圖6I），異位表達(dá)的AC020978表現(xiàn)出一定程度的核和胞漿PKM2信號的增加。
    我們猜測AC020978參與了PKM2/HIF-1α途徑的激活。首先，我們采用co-IP技術(shù)探討AC020978是否能調(diào)節(jié)PKM2與HIF-1α的相互作用。結(jié)果表明，敲除AC020978的功能受損，但AC020978的過表達(dá)明顯增強(qiáng)了PKM2和HIF-1α的相互作用（圖7A）。此外，為了可視化天然蛋白質(zhì)復(fù)合物，我們使用原位鄰近連接分析（圖7B）。在AC020978沉默條件下，發(fā)現(xiàn)含有PKM2和HIF-1α的PLA陽性蛋白復(fù)合物較少。相反，在AC020978高表達(dá)組中發(fā)現(xiàn)PKM2/HIF-1α簇的整體高密度，這與co-IP的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果一致。
    接下來，我們確定AC020978是否調(diào)節(jié)PKM2刺激的HIF-1α的反式作用。熒光素酶檢測結(jié)果表明，在缺氧條件下，PKM2的異位表達(dá)均能提高HRE報(bào)告活性，而AC020978和PKM2的聯(lián)合表達(dá)則能協(xié)同增強(qiáng)啟動子活性（圖7C）。缺氧條件下檢測HIF-1α靶向基因GLUT1、LDHA、ENO1和PDK1的表達(dá)。AC020978和PKM2的共轉(zhuǎn)染對所有這些基因都表現(xiàn)出較高的表達(dá)（圖7D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明AC020978增強(qiáng)PKM2增強(qiáng)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。

結(jié) 論：
    AC020978是一種上調(diào)的lncRNA，在NSCLC中具有臨床意義，有望成為NSCLC預(yù)后預(yù)測的獨(dú)立生物標(biāo)志物。靶向AC020978/PKM2/HIF-1α軸可能為NSCLC的防治提供新的視角。