外泌體circRNA參與腫瘤免疫治療

    外泌體，circRNA，腫瘤免疫微環(huán)境和腫瘤免疫治療的都是近年來生命科學研究熱點，也是國自然基金申請重點領域。今天我們講一篇2020年6月27日發(fā)表在Molecular Cancer的文章，題名：Cancer Cell-Derived Exosomal circUHRF1 Induces Natural Killer Cell Exhaustion and May Cause Resistance to anti-PD1 Therapy in Hepatocellular Carcinoma。這篇文章來自復旦大學附屬中山醫(yī)院研究團隊，文章主要講述了外泌體circUHRF1主要由HCC細胞分泌，通過誘導HCC中的NK細胞功能障礙參與免疫抑制，CircUHRF1可能驅動抗PD1免疫療法的耐藥性。

技術路線：

結 果：

1.肝癌組織中與UHRF1相關的circRNA的分析
    具有PHD和RING指域1（UHRF1）的泛素樣蛋白是參與調節(jié)DNA甲基化的關鍵分子，通常在包括HCC在內(nèi)的許多癌癥中過表達。UHRF1過表達可促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，作者推測UHRF1衍生的circRNA表達可能被上調并可能促進HCC的進展。
    qRT-PCR檢測從UHRF1衍生的14個circRNA的表達水平，qRT-PCR又檢測circUHRF1在240例HCC組織和癌旁的表達，肝癌組織高表達。circUHRF1 高表達的HCC患者腫瘤較大并血液中的NK細胞比例降低，微血管轉移增多。KM生存分析表明circUHRF1 高表達患者的臨床預后較差。數(shù)據(jù)表明，HCC細胞中circUHRF1表達上調與患者不良預后相關，并表明circUHRF1表達增加可能與HCC的進展有關。

2.HCC細胞以外泌體方式分泌circUHRF1
    從HCC細胞系上清液中分離了外泌體，并通過TEM和Western blot對其進行了評估。在6個HCC細胞系及對應的外泌體中進行qRT-PCR檢測， HCCLM3和SMMC-7721細胞系中circUHRF1顯著上調，且外泌體中circUHRF1的表達趨勢與親代細胞的一致。與健康供體相比，HCC患者的血漿外泌體circUHRF1水平升高。腫瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，而在腫瘤復發(fā)患者中升高，這表明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細胞產(chǎn)生。有免疫逃逸的患者血漿中外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血中NK細胞比例降低。這些數(shù)據(jù)表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細胞相關的免疫逃逸的關鍵分子。

3.HCC細胞通過外泌體circUHRF1抑制NK細胞功能
    將來自健康供體的NK細胞與HCCLM3和SMMC-7721細胞以1：1的比例共培養(yǎng)24h。與NK細胞相比， SMMC-7721和HCCLM3細胞共培養(yǎng)的NK細胞在隨后與K562細胞共培養(yǎng)時表現(xiàn)出IFN-γ和TNF-α分泌的顯著降低。SMMC-7721和HCCLM3細胞共培養(yǎng)的NK細胞中circUHRF1表達顯著增加，并受到外泌體抑制劑GW4869的抑制，抑制劑GW4869處理后IFN-γ和TNF-α表達恢復正常水平。使用shRNA慢病毒載體構建HCCLM3和SMMC-7721 circUHRF1敲低細胞。在circUHRF1敲低細胞中外泌體circUHRF1的表達顯著降低，外泌體circUHRF1水平的降低有效減弱了HCC衍生的外泌體誘導的NK細胞中IFN-γ和TNF-α分泌的損傷。結果表明，源自HCC的外泌體circUHRF1損害NK細胞的功能。

4.CircUHRF1和miR-449c-5p在NK細胞中相互作用
    通過StarBase v3.0分析，預測有14個miRNAs可能是circUHRF1的靶標。使用circUHRF1特異性探針進行circRNA免疫沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR檢測到了與circUHRF1形成復合體的14種預測miRNA。與對照相比，circUHRF1和miR-449c-5p顯著富集，而其他miRNA沒有富集或僅有少量富集。在NK-92細胞中進行了AGO2-RIP實驗，抗AGO2抗體顯著富集了circUHRF1和miR-449c-5p，pulldown和熒光素酶基因報告實驗也驗證這一結果。在NK-92細胞中過表達miR-449c-5p后，circUHRF1的水平顯著降低，而在circUHRF1過表達后，miR-449c-5p的水平顯著降低。結果證實，circUHRF1是miR-449c-5p分子海綿，且在在NK細胞中相互影響。miR-449c-5p的過表達表達顯著抑制腫瘤活性（促進IFN-γ和TNF-α分泌），增加circUHRF1表達可顯著抑制miR-449c-5p的腫瘤抑制功能，證明了HCC衍生的外泌體circUHRF1可能通過miR-449c-5p相關途徑抑制NK細胞功能的關鍵能力。

5.CircUHRF1通過抑制miR-449c-5p活性上調TIM-3表達
    StarBase v3.0預測了miR-449c-5p在TIM-3上的結合位點，熒光素酶基因報告實驗驗證預測結果。miR-449c-5p的過表達后TIM-3表達顯著降低。回復實驗表明miR-449c-5p過表達導致TIM-3的mRNA和蛋白表達降低，而circUHRF1逆轉了miR-449c-5p對TIM-3表達的抑制作用。接下來調查了40例HCC患者外周血NK細胞中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表達之間的相關性。外周血NK細胞中circUHRF1表達與miR-449c-5p表達負相關，且與TIM-3 mRNA表達呈正相關，miR-449c-5p表達與外周NK細胞中TIM-3 mRNA的表達呈負相關。表明外泌體circUHRF1的上調消除了miR-449c-5p對NK細胞中TIM-3的腫瘤抑制作用。

6.CircUHRF1以NK細胞依賴性方式誘導HCC進展
    使用慢病毒載體在PLC / PRF / 5細胞中構建circUHRF1過表達細胞系。結果顯示過表達成功，且外泌體中circUHRF1表達升高。使用上述細胞進行裸鼠肺轉移模型構建（注射健康供體的NK細胞），過表達circUHRF1的PLC / PRF / 5細胞轉移性腫瘤結節(jié)數(shù)顯著增加，轉移小鼠的血清外泌體circUHRF1水平升高，轉移性腫瘤結節(jié)中NKG2D陽性細胞的數(shù)量明顯減少。這些結果表明circUHRF1以外泌體和NK細胞依賴性方式促進HCC進展。

7.CircUHRF1增強HCC對抗PD1治療的抵抗力
    作者分析了30例接受抗PD1免疫治療的復發(fā)性遠處轉移（包括肺轉移）的HCC患者的回顧性數(shù)據(jù)，這些患者在免疫治療前2-36個月接受了肝切除術。六個治療周期后，使用CT評估療效。結果顯示，部分緩解（PR）3例，疾病穩(wěn)定（SD）7例，進行性疾?。≒D）20例。測量circUHRF1的表達顯示，PD組的circUHRF1的表達水平遠高于SD和PR組。為了進一步探討circUHRF1與免疫逃避之間的關系，檢查了30例HCC患者組織中NKG2D的表達。與易受PD1治療的HCC患者相比，抗PD1治療的HCC患者的NKG2D陽性細胞數(shù)量明顯減少，HCC組織中circUHRF1表達與NKG2D陽性細胞數(shù)呈負相關。為了進一步評估circUHRF1對抗PD1治療的抗性，通過皮下植入circUHRF1基因敲除的HCCLM3細胞建立了異種移植模型。circUHRF1敲低細胞可提高對抗PD1治療的敏感性并提高總生存率。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明過表達circUHRF1可能會阻礙HCC對抗PD1治療的反應，而靶向circUHRF1可能是恢復HCC對抗PD1治療敏感性的有前途和有效的方法。

結 論：
    HCC衍生的外泌體通過誘導NK細胞上TIM-3表達來抑制IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。腫瘤外泌體通過circUHRF1抑制NK細胞功能，為HCC細胞與NK細胞之間的串擾提供了新證據(jù)。