禁食與結(jié)直腸癌發(fā)展

    有證據(jù)表明，禁食對包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥都有廣泛的抗腫瘤作用。然而，禁食參與結(jié)直腸癌進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。因此，小編為大家?guī)戆l(fā)表于“NATURE COMMUNICATIONS”上的文章“Fasting inhibits aerobic glycolysis and proliferation in colorectal cancer via the Fdft1-mediated AKT/mTOR/HIF1α pathway suppression”，給大家詳細(xì)介紹禁食參與結(jié)直腸癌的機(jī)制。

    在本文中，我們發(fā)現(xiàn)，在抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞有氧糖酵解和增殖的過程中，禁食會上調(diào)FDFT1的表達(dá)。FDFT1的下調(diào)與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)。此外，F(xiàn)DFT1在結(jié)直腸癌中起著重要的抑癌作用。在機(jī)制上，F(xiàn)DFT1通過負(fù)調(diào)控AKT/mTOR/HIF1α信號來發(fā)揮抑瘤作用。
結(jié) 果：
1.禁食損害糖酵解和抑制結(jié)直腸癌增殖
    為了探討禁食對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，我們采用CCK8和EdU檢測細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)禁食顯著抑制CRC細(xì)胞增殖（圖1a，b，d）。接著，為了評估禁食對大腸癌增殖的影響，我們進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析（圖1c）?！疤墙徒?糖異生”途徑受到高度下調(diào)（圖1c）。為了驗(yàn)證禁食對葡萄糖代謝的影響，我們檢測了葡萄糖攝取量和乳酸生成量。結(jié)果表明禁食降低了細(xì)胞中葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生（圖1e，f）。細(xì)胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）在禁食模擬培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中降低（圖1h，1i）。此外，在禁食模擬培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CT26和SW620細(xì)胞中，葡萄糖代謝中限速酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)下調(diào)（圖1g，k）。這些數(shù)據(jù)表明，禁食在抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞糖酵解方面起著至關(guān)重要的作用。
    為了進(jìn)一步驗(yàn)證禁食對體外葡萄糖代謝的影響，我們將CT26細(xì)胞皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，禁食明顯減弱了小鼠的腫瘤生長（圖1j，l，m，o）。此外，我們使用18F-FDG microPET/CT成像系統(tǒng)來評估空腹在葡萄糖代謝中的作用。禁食顯著抑制體內(nèi)異種移植模型中18F-FDG的攝取（圖1n，p）。綜上所述，禁食損害糖酵解和抑制結(jié)直腸癌增殖。

2.FDFT1在CRC中因禁食上調(diào)并與預(yù)后相關(guān)
    首先，我們證實(shí)禁食可以上調(diào)FDFT1的表達(dá)。在GSE60653數(shù)據(jù)集中，與對照組相比，禁食組中FDFT1的表達(dá)顯著增加（圖2a）。此外，在iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，與對照組相比，禁食組FDFT1的相對表達(dá)顯著升高（圖2b）。qRT-PCR結(jié)果表明，禁食組FDFT1的mRNA表達(dá)明顯增加（圖2c），WB顯示禁食模擬培養(yǎng)基提高了細(xì)胞內(nèi)FDFT1的蛋白水平（圖2d，e）。因此，我們的結(jié)果表明，禁食可以上調(diào)結(jié)直腸癌中FDFT1的表達(dá)。接著，我們采用IHC和qRT-PCR方法，比較了FDFT1在人結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。FDFT1在大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)（圖2f，g）。另外，結(jié)直腸癌組織中的FDFT1水平明顯低于非癌組織（圖2h）。因此，F(xiàn)DFT1在結(jié)直腸癌組織中下調(diào)。
    為了確定FDFT1在結(jié)直腸癌中的作用，我們評估了結(jié)直腸癌患者FDFT1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。FDFT1的低表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化、浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分 期密切相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示，高表達(dá)的FDFT1預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后更好（圖2i）。
    最后，為了驗(yàn)證FDFT1在CRC中的作用，我們使用GEO和GEPIA數(shù)據(jù)庫來分析TCGA數(shù)據(jù)集。在GDS2609和GDS4382數(shù)據(jù)集中，結(jié)直腸癌組織中FDFT1基因的表達(dá)明顯低于正常組織（圖2j、k）。此外，GEPIA數(shù)據(jù)庫在結(jié)直腸癌患者中，低FDFT1與高TNM分期相關(guān)（圖2l）。TCGA數(shù)據(jù)集的生存分析表明，F(xiàn)DFT1的高表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)（圖2m）?？傊@些結(jié)果表明FDFT1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)。

3.FDFT1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用
    為了評估FDFT1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能，在CT26和SW620細(xì)胞中進(jìn)行了慢病毒介導(dǎo)的FDFT1過表達(dá)和敲除。如qPCR和WB結(jié)果所示，在CT26和SW620細(xì)胞中，F(xiàn)DFT1過表達(dá)（圖3a，b）和敲除（圖3c，d）的效率是有效的。CCK8、EdU和集落形成試驗(yàn)表明，F(xiàn)DFT1過表達(dá)抑制CRC細(xì)胞增殖，而FDFT1基因敲除促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖（圖3e-n）為了進(jìn)一步研究FDFT1對細(xì)胞侵襲的影響，我們進(jìn)行了transwell實(shí)驗(yàn)。FDFT1過表達(dá)抑制了細(xì)胞侵襲（圖3o，p），而FDFT1基因敲除增加了細(xì)胞侵襲（圖3q，r）?？傊?，F(xiàn)DFT1的過表達(dá)抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

4.FDFT1是CRC患者禁食的重要下游靶點(diǎn)
    我們評估禁食對結(jié)直腸癌的抑制作用是否隨著FDFT1的過表達(dá)而增強(qiáng)。我們的數(shù)據(jù)表明，與單獨(dú)治療相比，F(xiàn)DFT1過表達(dá)聯(lián)合禁食對CRC細(xì)胞增殖的抑制作用最大（圖4a）。此外，WB結(jié)果表明，禁食和FDFT1的過表達(dá)增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞中FDFT1的蛋白水平。在抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖中，禁食對過表達(dá)FDFT1的細(xì)胞中FDFT1的表達(dá)水平產(chǎn)生了相加效應(yīng)（圖4b）。接著，為了證實(shí)FDFT1過表達(dá)與禁食聯(lián)合應(yīng)用對體外觀察到的細(xì)胞增殖的影響，我們將CT26細(xì)胞和FDFT1高表達(dá)的CT26細(xì)胞皮下注射BALB/c小鼠。我們的結(jié)果表明，F(xiàn)MD和FDFT1的過表達(dá)都抑制了小鼠的腫瘤生長。與單用FMD或單用FDFT1高表達(dá)相比，F(xiàn)MD聯(lián)合FDFT1高表達(dá)對小鼠腫瘤生長的抑制作用最為顯著（圖4c，d）。與這些結(jié)果一致，在異種移植模型中，F(xiàn)MD聯(lián)合FDFT1過表達(dá)對18F-FDG攝取具有最顯著的抑制作用（圖4e，f）。此外，IHC結(jié)果表明，F(xiàn)MD或FDFT1的過表達(dá)均能提高體內(nèi)FDFT1的蛋白水平。（圖4g，h）。最后，為了證實(shí)我們的體外觀察，我們在BALB/c小鼠皮下注射CT26細(xì)胞和FDFT1基因敲除CT26細(xì)胞。當(dāng)FMD聯(lián)合FDFT1敲除CT26細(xì)胞植入體內(nèi)時，禁食對CRC腫瘤生長的抑制作用被逆轉(zhuǎn)（圖4j，k）?？傊@些結(jié)果表明FDFT1是禁食的一個重要下游靶點(diǎn)， 它介導(dǎo)了CRC細(xì)胞增殖的抑制。

5.在CRC中mTOR水平與FDFT1水平呈負(fù)相關(guān)
    為了確定FDFT1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的信號通路，我們再次進(jìn)行了蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)分析。我們推測FDFT1抑制了mTOR相關(guān)通路，從而抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的糖酵解。我們發(fā)現(xiàn)FDFT1的表達(dá)與mTOR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖5a，5b）。接著，我們評估了mTOR沉默對FDFT1表達(dá)水平的影響，以及用mTOR抑制劑治療是否會逆轉(zhuǎn)FDFT1基因敲除的影響。我們發(fā)現(xiàn)mTOR沉默增加了CT26細(xì)胞中FDFT1的表達(dá)水平。mTOR抑制劑可防止FDFT1基因敲除細(xì)胞中mTOR蛋白水平的升高（圖5c-f）。此外，我們通過CCK8檢測mTOR對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)mTOR的沉默降低了細(xì)胞增殖（圖5g，h）。這表明mTOR是結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的一個陽性調(diào)節(jié)因子。其次，我們評估m(xù)TOR對結(jié)直腸癌細(xì)胞糖酵解的影響。沉默mTOR可降低CRC細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成以及糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖5i-o）。最后，我們分析了TCGA數(shù)據(jù)集中mTOR表達(dá)與相關(guān)糖酵解基因編碼的蛋白表達(dá)的相關(guān)性。mTOR的表達(dá)與它們的表達(dá)有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖5p-t）。因此，這些觀察結(jié)果支持了mTOR對CRC細(xì)胞增殖中有氧糖酵解的積極調(diào)節(jié)的假設(shè)。

6.FDFT1通過抑制CRC中AKT-mTOR-HIF1通路來抑制糖酵解
    我們的結(jié)果表明FDFT1在CT26和SW620細(xì)胞中是葡萄糖代謝的負(fù)調(diào)控因子（圖6a-j）。此外，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FDFT1降低了CRC細(xì)胞中AKT、mTOR和HIF1細(xì)胞的蛋白和mRNA的表達(dá)(圖6k，n)。相反，F(xiàn)DFT1基因敲除增加了AKT、mTOR和HIF1細(xì)胞的蛋白和mRNA表達(dá)（圖6l，n）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)DFT1通過抑制CRC中的AKT-mTOR- HIF1α途徑來抑制糖代謝。

7.禁食與mTOR抑制劑協(xié)同抑制CRC增殖及FDFT1/AKT-mTOR-HIF1α通路在CRC患者中的臨床意義
    我們探討了雷帕霉素是否能與FMD協(xié)同抑制結(jié)直腸癌的增殖。結(jié)果表明，F(xiàn)MD和1 mg/kg劑量的雷帕霉素均能強(qiáng)烈抑制CRC的增殖，顯著提高生存率（圖7a-c）。此外，我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素治療可以增加FDFT1蛋白和mRNA的表達(dá)水平（圖7d，e）。我們還發(fā)現(xiàn)禁食和雷帕霉素在延緩結(jié)直腸癌進(jìn)展、提高生存率和上調(diào)FDFT1方面有協(xié)同作用（圖7a-e）。接著，我們分析了TCGA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn) FDFT1高表達(dá)和AKT1、mTOR、HIF1α、GLUT1和HK2低表達(dá)的患者比FDFT1低表達(dá)、AKT-mTOR-HIF1α途徑和糖酵解基因高表達(dá)的患者存活時間更長（圖7f-j）。

結(jié) 論：
    禁食通過FDFT1/AKT-mTOR-HIF1α軸對結(jié)直腸癌細(xì)胞葡萄糖代謝和增殖具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。基于mTOR抑制的治療可能是一種有前途的治療CRC的方法。