腎細(xì)胞癌中常規(guī)思路的10分文章詳覽

    腎細(xì)胞癌（RCC）是泌尿外科中導(dǎo)致患者死亡的第二大腫瘤，僅在2018年就有約403426個(gè)新增病例。但是其治療始終沒有非常樂觀的進(jìn)展。circRNA在許多疾病中被證實(shí)具有調(diào)控作用，并可作為治療靶標(biāo)，但是在RCC中的作用尚不清楚。本文旨在探究RCC中是否存在某個(gè)關(guān)鍵circRNA參與調(diào)控了RCC的惡性進(jìn)展，并于今年6月5日新近發(fā)表在《Molecular Cancer》（IF:10.679）期刊上。
結(jié) 果：
1、CircTLK1在RCC組織中過表達(dá)并于其不良預(yù)后有關(guān)
    通過腎上皮細(xì)胞和RCC細(xì)胞測(cè)序獲得差異表達(dá)序列，F(xiàn)ig. 1a是最顯著差異的10個(gè)circRNA。CircTLK1不僅在RCC細(xì)胞系和RCC組織中高表達(dá)，在術(shù)后轉(zhuǎn)移中RCC病人中也高表達(dá)，并預(yù)示著不良預(yù)后（Fig. 1b-f）。CircTLK1長(zhǎng)247nt，包含兩個(gè)外顯子，不可被RNase R消化（Fig. 1g-i）。

圖1 CircTLK1在RCC組織中過表達(dá)并于其不良預(yù)后有關(guān)

2、敲除circTLK1抑制RCC細(xì)胞增殖
    shRNA-2可顯著抑制三種細(xì)胞系中circTLK1的表達(dá)，但對(duì)TLK1的表達(dá)沒有影響（Fig.a-c）。此外，使用shRNA-2干擾掉circTLK1的表達(dá)后RCC細(xì)胞的增殖能力顯著下降。

圖2敲除circTLK1抑制RCC細(xì)胞增殖

3、敲除circTLK1抑制RCC細(xì)胞遷移和侵襲

    如圖3a-c所示，shRNA-2干擾circTLK1的表達(dá)后RCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降。鑒于這種影響，作者進(jìn)一步檢測(cè)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果表明在circTLK1沉默的細(xì)胞中，間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和vimentin表達(dá)明顯下降，而上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)在circTLK1抑制的細(xì)胞中升高（圖3e）。

圖3敲除circTLK1抑制RCC細(xì)胞遷移和侵襲

4、circTLK1作為miR-136-5p海綿

    為分析circTLK1的分子途徑，使用FISH和核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)circTL1K的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示主要分布在細(xì)胞質(zhì)（Fig.4a-b），這暗示著circTLK1可能通過捕獲miRNA釋放其靶基因轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮功能。在線預(yù)測(cè)獲得5個(gè)可與circTL1K結(jié)合的miRNA，然后生物素circTL1K探針在RCC細(xì)胞中顯著下拉circTLK1，而miR-136-5p是惟一被生物素circTL1K探針下拉的miRNA（Fig.4c-d）。之后熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)兩者間的作用關(guān)系（Fig.4e-f）。然而，過表達(dá)或敲除circTL1K對(duì)RCC細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)沒有影響（Fig.4i-j）。這些表明circTLK1對(duì)miR-136-5p起海綿吸附作用。

圖4 circTLK1作為miR-136-5p海綿

5、miR-136-5p通過靶向CBX4促進(jìn)RCC進(jìn)展

    在線預(yù)測(cè)miR-136-5p的靶基因有CBX4，GNAS，LUZP6，MSL2，MTMR4和SOCS7（Fig 5a），并進(jìn)一步通過綜合轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)miR-136-5p與CBX4的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（Fig 5b）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)染miR-136-5p與野生型CBX4質(zhì)粒后熒光素酶活性顯著升高，而轉(zhuǎn)染突變型CBX4則沒有變化（Fig 5c-d）。過表達(dá)miR-136-5p抑制了CBX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平（Fig 5e-g）。這些表明miR-136-5p直接靶向CBX4。此外，CBX4在RCC組織中上調(diào)表達(dá)，且與腫瘤大小和術(shù)后轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（Fig 5i-j）。RCC病人中高表達(dá)CBX4具有較低的總體生存率（Fig 5k）。

圖5 CBX4是miR-136-5p的直接靶點(diǎn)

6、CBX4敲除抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲

    如圖6所示，使用shRNA干擾CBX4表達(dá)后，ACHN 和769-P細(xì)胞系的增殖，集落形成，遷移和侵襲能力都顯著下降。此外，CBX4的表達(dá)與VEGFA的表達(dá)呈正相關(guān)，shRNA干擾CBX4表達(dá)后VEGFA的表達(dá)顯著抑制。

圖6 CBX4敲除抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲

7、過表達(dá)CBX4逆轉(zhuǎn)了circTLK1對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用

    為了探究circTLK1是否通過調(diào)控CBX4的表達(dá)改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，作者做了一個(gè)circTLK1和CBX4的拯救實(shí)驗(yàn)。如圖7所示，敲除circTLK1明顯抑制了CBX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平。CBX4過表達(dá)顯著扭轉(zhuǎn)了circTLK1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。在細(xì)胞的遷移，侵襲，集落形成實(shí)驗(yàn)中得出了一致的結(jié)果。上述表明circTLK1是通過調(diào)控CBX4的表達(dá)改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。

圖7過表達(dá)CBX4逆轉(zhuǎn)了circTLK1對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用

8、circTLK1敲低可抑制體內(nèi)RCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

    為了探究在體內(nèi)circTLK1對(duì)RCC腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移的作用，構(gòu)建了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染了shcircTLK1的769-P細(xì)胞并注射到裸鼠中從而構(gòu)建裸鼠腫瘤移植及肺轉(zhuǎn)移模型。在腫瘤異種移植模型中，與shNC相比，shcircTLK1的小鼠腫瘤明顯更小，腫瘤的體積和和腫瘤也都顯著下降（Fig. 8a-c）。此外，shcircTLK1小鼠體內(nèi)的Ki67，CBX4和VEGFA的表達(dá)水平顯著下降（Fig. 8d-e）。在肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型中，shcircTLK1小鼠的肺轉(zhuǎn)移顯著減少（Fig. 8f-h）。在腫瘤異種移植模型中，過表達(dá)CBX4逆轉(zhuǎn)了shcircTLK1誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制（Fig. 8i-k）。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明circTLK1可能在促進(jìn)RCC的體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

圖8 circTLK1敲低可抑制體內(nèi)RCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

    總之，作者證明了circTLK1通過海綿吸附miR- 136-5p來調(diào)節(jié)CBX4的表達(dá)，從而促進(jìn)了RCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(圖8l)。

參考文獻(xiàn):

    Li Jianfa., Huang Chenchen., Zou Yifan., Ye Jing., Yu Jing., Gui Yaoting.(2020). CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol. Cancer, 19(1), 103. doi:10.1186/s12943-020-01225-2