自噬依賴性鐵死亡驅(qū)動(dòng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化

導(dǎo) 語(yǔ)：
    腫瘤微環(huán)境（TME）：由惡性腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和其他成分組成的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，影響著癌癥的發(fā)展和治療。設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤微環(huán)境TME內(nèi)癌細(xì)胞與周圍免疫細(xì)胞之間的相互作用信號(hào)和分子的新型抗癌藥是腫瘤治療的熱點(diǎn)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是招募入腫瘤微環(huán)境TME的骨髓源性免疫細(xì)胞。自噬是體內(nèi)的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制，在腫瘤生物學(xué)中起作用。自噬依賴性鐵死亡與巨噬細(xì)胞的極化有何聯(lián)系，今天，我們先睹為快。

技術(shù)路線:

結(jié) 果:
1. 癌細(xì)胞自噬依賴性鐵毒性死亡期間，釋放KRASG12D到細(xì)胞外
    PDAC的啟動(dòng)和發(fā)展與氧化應(yīng)激有關(guān)。H2O2誘導(dǎo)兩種人類PDAC細(xì)胞系PANC1、AsPC1細(xì)胞以及原代人PDAC細(xì)胞釋放KRASG12D，H2O2引起的細(xì)胞死亡和釋放KRASG12D（圖1C）可被自噬抑制劑阻斷，但凋亡抑制劑或壞死性凋亡抑制劑沒(méi)有此效應(yīng)。凋亡抑制劑Z-VAD-FMK有效阻止星形孢菌素引起的死亡，壞死抑制劑阻止了PANC1細(xì)胞中的TNF+ Z-VAD-FMK +放線菌酮的致死效應(yīng)。此外，敲除自噬相關(guān)基因抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和KRASG12D釋放，表明自噬依賴性細(xì)胞死亡促進(jìn)氧化應(yīng)激期間KRASG12D蛋白的釋放。研究表明自噬依賴性細(xì)胞死亡是一種獨(dú)特的脂質(zhì)過(guò)氧化介導(dǎo)的死亡。鐵死亡抑制劑阻止H2O2誘導(dǎo)的自噬體標(biāo)記MAP1LC3B形成、細(xì)胞死亡和KRASG12D釋放。鐵死亡誘導(dǎo)劑效果相反。這些表明，鐵死亡可導(dǎo)致PDAC細(xì)胞釋放KRASG12D蛋白。

2. 巨噬細(xì)胞攝取外泌體KRASG12D需要AGER
    外泌體是內(nèi)體來(lái)源的細(xì)胞外囊泡，氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。在PANC1和AsPC1細(xì)胞分離外泌體，外泌體大小為50-150 nm，表達(dá)外泌體陽(yáng)性標(biāo)記，但不表達(dá)陰性標(biāo)記。外泌體中KRASG12D蛋白增加，氯喹、敲低ATG5和ferrostatin-1阻斷外泌體中H2O2誘導(dǎo)的KRASG12D蛋白積累。外泌體生物抑制劑GW4869和RAB27A抑制PANC1細(xì)胞釋放KRASG12D。絕大多數(shù)1萬(wàn)或10萬(wàn)離心后的沉淀是外泌體，觀察到KRASG12D存在于10K或100K離心后的蛋白質(zhì)顆粒。這些發(fā)現(xiàn)表明自噬依賴鐵死亡導(dǎo)致含KRASG12D的外泌體釋放。
    人外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（PBMCM）通常不含KRASG12D，但以時(shí)間依賴性方式攝取H2O2誘導(dǎo)的腫瘤外泌體，提示腫瘤KRASG12D可以進(jìn)入巨噬細(xì)胞。用H2O2誘導(dǎo)的癌癥外泌體培養(yǎng)PBMCM，抗AGER抗體或敲低AGER，抑制PBMCM吸收KRASG12D。這些發(fā)現(xiàn)表明AGER介導(dǎo)巨噬細(xì)胞攝取KRASG12D。

3. KRASG12D通過(guò)STAT3依賴性脂肪酸氧化促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化
    PBMCM中過(guò)表達(dá)KRASG12D，M1分化生物標(biāo)志物上調(diào)，H2O2誘導(dǎo)的癌癥外泌體也增加PBMCM的M2標(biāo)記表達(dá)，表明攝取KRASG12D可能會(huì)導(dǎo)致致癌的M2極化。脂肪酸氧化可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。過(guò)表達(dá)KRASG12D或 H2O2誘導(dǎo)的的癌癥外泌體可增加PBMCM中的脂肪酸氧化，該過(guò)程被敲低AGER所抑制，加入脂肪酸氧化藥理抑制劑課抑制M2極化。以上表明，脂肪酸氧化有助于KRASG12D介導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化。p-STAT3在過(guò)表達(dá)KRASG12D或癌癥外泌體處理的PBMCM中被上調(diào)，STAT3磷酸化被敲低AGER抑制。敲低STAT3減少PBMCM細(xì)胞脂肪酸氧化和M2巨噬細(xì)胞極化。由此可見(jiàn)，KRASG12D誘導(dǎo)的脂肪酸氧化和M2極化需要AGER介導(dǎo)的STAT3激活。脂肪酸氧化代謝途徑的基因CPT1A和ACADM在過(guò)表達(dá)KRASG12D的PBMCM中上調(diào)，該作用被AGER或STAT3的敲低所抑制。以上結(jié)果表明，AGER-STAT3途徑對(duì)于KRASG12D誘導(dǎo)的脂肪酸氧化和隨后的巨噬細(xì)胞M2極化至關(guān)重要。

4. 阻斷KRASG12D的釋放和攝取可抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)
    利用免疫缺陷的NOD SCID小鼠建立異種移植瘤模型，與單獨(dú)PANC1細(xì)胞相比，PBMCMs促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(zhǎng)，局部注射氯喹，ferrostatin-1或抗AGER抗體抑制PANC1加PBMCM引起的腫瘤生長(zhǎng)，PANC1細(xì)胞中敲低ATG5或PBMCM中敲低AGER，降低PANC1細(xì)胞和PBMCM所產(chǎn)生的腫瘤生長(zhǎng)。敲低STAT3，ATG5，CPT1A或RAB27A可令過(guò)表達(dá)KRASG12D的PBMCMs細(xì)胞失去腫瘤促進(jìn)作用。這些發(fā)明，將KRASG12D或KRASG12D蛋白轉(zhuǎn)移到PBMCM中可驅(qū)動(dòng)PDAC進(jìn)展，這一效應(yīng)涉及ATG5，STAT3，CPT1A和RAB27A途徑。

5. 巨噬細(xì)胞中高KRASG12D表達(dá)與PDAC存活率低有關(guān)
    使用59位胰腺癌患者的組織芯片，在CD68 +巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到KRASG12D的表達(dá)。CD68 +巨噬細(xì)胞高表達(dá)KRASG12D的患者（高KRASG12D巨噬細(xì)胞組），總體生存率比低KRASG12D巨噬細(xì)胞組的患者低。這些表明巨噬細(xì)胞對(duì)KRASG12D的攝取增加可能與人類胰腺癌進(jìn)展有關(guān)。

總結(jié)：
    1. KRASG12D，一種與損傷相關(guān)的分子模式（DAMP），在氧化應(yīng)激期間從細(xì)胞釋放；
    2.自噬依賴性的鐵死亡是ROS誘導(dǎo)的PDAC細(xì)胞釋放KRASG12D所必須；
    3. KRASG12D可通過(guò)外泌體從鐵死亡癌細(xì)胞傳遞至巨噬細(xì)胞；
    4. KRASG12D通過(guò)STAT3依賴性的脂肪酸氧化激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化；
    5. KRASG12D轉(zhuǎn)移（從癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞）的藥理和遺傳抑制作用，可抑制巨噬細(xì)胞刺激的人PDACs生長(zhǎng)。