外泌體circPACRGL促進(jìn)結(jié)直腸癌

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2020-10-26
結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。外泌體是細(xì)胞間通信的重要調(diào)節(jié)因子，外泌體中豐富的circRNA。circRNA是調(diào)控腫瘤增殖和進(jìn)展的非編碼RNA的一部分。然而，癌源性外泌體circRNA在CRC中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚...

    結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。外泌體是細(xì)胞間通信的重要調(diào)節(jié)因子，外泌體中豐富的circRNA。circRNA是調(diào)控腫瘤增殖和進(jìn)展的非編碼RNA的一部分。然而，癌源性外泌體circRNA在CRC中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院的商安全等人在Molecular Cancer（IF=15.302）這一雜志發(fā)表文章介紹circPACRGL在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌中的作用。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.CRC來源的外泌體增強(qiáng)CRC增殖、遷移和侵襲

    為了探討外泌體在CRC中的作用機(jī)制，從HCT116和SW480細(xì)胞上清中分離出外泌體。通過透射電子顯微鏡和納米粒子跟蹤分析(NTA)方法發(fā)現(xiàn)圓形粒子是80-100nm的雙層膜，符合外泌體大小(圖1 a和b)。WB檢測外泌體特征標(biāo)記物（CD9, CD54，Annexin，GM130）的表達(dá)，驗(yàn)證提取到的是外泌體。CCK8檢測顯示外泌體顯著增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的增殖(圖1d)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CRC細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比明顯降低(圖1e)。此外，傷口愈合和transwell表明,液從CRC細(xì)胞的外泌體能顯著促進(jìn)CRC的遷移和侵襲(圖1 f和g)。此外,WB結(jié)果表明CRC來源的外泌體增加BCL-2, N-cadherin, Vimentin,和MMP9的表達(dá)，減少reduced E-cadherin,Cleaved-caspase3, Cleaved-caspase9 蛋白的表達(dá)(圖1 h)。裸鼠尾靜脈注射外泌體處理的-HCT1 116 -熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞，體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)外泌體處理顯著增加了HCT116細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明CRC來源的外泌體促進(jìn)CRC增殖、遷移和侵襲。

2.腫瘤來源外泌體處理的CRC細(xì)胞中circPACRGL顯著上調(diào)

    報道顯示circRNAs在腫瘤來源的外泌體中富集。我們分析了三對外泌體刺激的HCT116和SW480的表達(dá)譜，和未處理細(xì)胞的RNA測序來識別與CRC相關(guān)的circRNA(圖2a)。SW480和HCT116的差異表達(dá)由Venn圖顯示。circPAGRAL(circ-0069313)是兩組中表達(dá)上調(diào)最多的基因(圖2b)，并通過RT-qPCR驗(yàn)證(圖2c)。外泌體刺激的CRC細(xì)胞中circPAGRAL水平持續(xù)且顯著升高(圖2c)。這與CRC細(xì)胞中使用CRC患者血清來源外泌體處理的結(jié)果不一致(圖2d)。我們進(jìn)一步從CRC患者的腫瘤組織中分離出外泌體。qRT-PCR結(jié)果顯示，circPAGRAL在經(jīng)腫瘤來源外泌體處理的CRC細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)(圖2e)。這些結(jié)果表明在腫瘤來源外泌體刺激的CRC細(xì)胞中circPACRGL顯著升高，circPACRGL可能來源于腫瘤來源的外泌體。

    RT-qPCR檢測驗(yàn)證了在HCT116和SW480細(xì)胞中circPACRGL沉默導(dǎo)致其表達(dá)明顯降低(圖2f)。與腫瘤來源的外泌體共培養(yǎng)后，兩種CRC細(xì)胞中circPACRGL mRNA表達(dá)顯著升高(圖2g)。這些結(jié)果表明circPACRGL主要來源于腫瘤來源的外泌體，而不是來源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表型變化。

3.circPACRGL作為miR-142-3p和mir-506-3p的海綿

    在細(xì)胞質(zhì)中，許多證據(jù)表明circRNA的調(diào)控機(jī)制是作為miRNA海綿。FISH熒光原位雜交結(jié)果顯示，circPACRGL轉(zhuǎn)錄信號主要分布在HCT116和SW480細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖3a)。在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫StarBase 2.0分析circPACRGL靶miRNA，發(fā)現(xiàn)circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖3b)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-142-3p和miR-506-3p是circPACRGL的靶點(diǎn)。與miR-NC相比，circPACRG -wt和細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-142-3p/miR-506-3p mimics，熒光素酶活性明顯下降。同時，細(xì)胞miR-142-3p和miR-506-3p mimics和circPACRGL-mut顯示熒光素酶活性變化小(圖3 c)。此外,我們發(fā)現(xiàn)CRC來源的外泌體刺激的HCT116和SW480細(xì)胞miR-142-3p/miR-506-3p表達(dá)顯著減少(圖3 d)。這些結(jié)果表明circPACRGL可以作為miR-142-3p和miR-506-3p的海綿。

4.TGF-β1是miR-142-3p/miR-506-3p的共同靶點(diǎn)

    MiRNAs可與調(diào)控mRNA和蛋白表達(dá)的基因3′UTR結(jié)合。在線生物信息學(xué)工具StarBase 2.0預(yù)測miR-142-3p和miR-506-3p的靶基因,發(fā)現(xiàn)了TGF-β1。有報道TGF-β1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與N1/N2中性粒細(xì)胞的分化相關(guān)。熒光素酶報告基因檢測，證實(shí)TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p共同的靶基因(圖4a和b)。HEK293T細(xì)胞在共轉(zhuǎn)染miR-142-3p/miR-506-3p mimics和TGF-β1-wt后熒光素酶活性明顯降低。然而，miR-142-3p/miR-506-3p-mut挽救了這種抑制(圖4b)。WB和qPCR進(jìn)一步表明，miR-142-3p/miR-506-3p mimics 轉(zhuǎn)染顯著降低TGF-β1的蛋白質(zhì)和mRNA水平(圖4 c和d)。

    在外泌體處理的CRC細(xì)胞中，TGF-β1蛋白質(zhì)和mRNA水平顯著增加；而在與miR-142-3p/miR-506-3p抑制劑共培養(yǎng)之后，這種上調(diào)作用顯著的抑制(圖4 e和f)。研究表明, TGF-β1是miR-142-3p/miR-506-3p的一種常見靶標(biāo)。4

5.circPACRGL通過調(diào)控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1，促進(jìn)CRC增殖、遷移和侵襲

    CCK8結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)CRC來源的外泌體處理之后CRC細(xì)胞的增殖能力明顯提高(圖5a)。下調(diào)circPACRGL可顯著降低CRC細(xì)胞的增殖，而在miR-142-3p/miR-506-3p 抑制劑處理或TGF-β1過表達(dá)后，這種抑制作用減弱(圖5a)。外泌體刺激的CRC細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例降低。下調(diào)circPACRGL可促進(jìn)CRC細(xì)胞凋亡，但這種增強(qiáng)作用被外泌體刺激所抑制。miR-142-3p/miR-506-3p 抑制劑處理或TGF-β1過表達(dá)后，CRC細(xì)胞的凋亡率顯著降低(圖5b)。傷口愈合和transwell表明，CRC來源外泌體提高CRC細(xì)胞遷移和入侵的能力；circPACRGL敲除后，作用相反(圖5 c和d)。結(jié)果證實(shí)circPACRGL通過調(diào)控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1促進(jìn)CRC增殖、遷移和侵襲。

6.CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1調(diào)控N1-N2中性粒細(xì)胞的分化

    研究報道顯示高水平的TGF-β1與腫瘤的發(fā)生，N1中性粒細(xì)胞向N2中性粒細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換有關(guān)，而N2中性粒細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。我們探討了CRC來源的外泌體 circPACRGL是否也可以通過這個軸調(diào)控中性粒細(xì)胞的N1-N2分化。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CRC來源的外泌體可以增加N2中性粒細(xì)胞的百分比，這與N2標(biāo)記CD11b+/Ly6G+/Ly6Clow的上調(diào)一致(圖6). 在circPACRGL敲低的細(xì)胞組中顯著降低，而這種抑制作用加入CRC來源的外泌體后消失。然而，miR-142-3p/miR-506-3p抑制劑處理或TGF-β1高表達(dá)可顯著加速N1-N2的分化在CRC來源的外泌體處理的circPACRGL敲低細(xì)胞中?？偟膩碚f，我們發(fā)現(xiàn)CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調(diào)控N1-N2中性粒細(xì)胞的分化。

總結(jié)：

  1. 文章中發(fā)現(xiàn)了腫瘤來源外泌體中circPACRGL。

  2. 研究發(fā)現(xiàn)了circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF- 271增強(qiáng)CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，以及N1-N2中性粒細(xì)胞的分化。

  3. 研究發(fā)現(xiàn)了circPACRGL在CRC細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移中起著致癌作用。

  4. 文章為研究circRNA在CRC中的作用提供了理論依據(jù)。