新研究揭示PD-1通路調節(jié)ILC2代謝，PD-1激動劑治療可改善氣道高反應性

    最近在Nature communication上線了一篇標題為 “PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity” 的文章。該文的通訊作者是來自美國南加州大學凱克醫(yī)學院分子微生物學與免疫學學系的Omid Akbari。
    過敏性哮喘是一種與呼吸系統(tǒng)癥狀有關的慢性疾病，如呼吸短促、胸悶和咳嗽火性氣道疾病。
    近幾十年來，哮喘的流行率顯著增加，全世界約有3.39億人受到影響。因此，確定新的治療靶點已成為確保該病有效控制的必要。哮喘的動物模型可以很好地用來模擬哮喘的臨床特征，主要是氣道高反應性(AHR)，它依賴于T-helper 2 (Th2)細胞因子的分泌;白介素(IL)-5促進嗜酸性粒細胞進入肺，而IL-13誘導杯狀細胞增生和粘液生成。雖然Th2細胞被公認為2型炎癥的關鍵控制者，但2型先天淋巴樣細胞(ILC2s)的早期激活已成為哮喘啟動和放大的關鍵步驟.

    PD-1是B7/CD28家族成員，主要表達在活化的T細胞、B細胞和巨噬細胞上。配體結合PD-1, PD-L1 PD-L2,緊隨其后的是一連串的胞內信號,導致T細胞抑制和疲憊,PD-1胞質域進行磷酸化的酪氨酸殘基,促進招聘的蛋白質酪氨酸磷酸酶(中),主要是Src同源區(qū)域2 domain-containing phosphatase-2 (SHP-2)。這隨后導致細胞存活和增殖所必需的幾種激酶的去磷酸化。由于PD-1通路具有恢復T細胞功能的能力，阻斷PD-1通路已成為多種腫瘤的治療策略。目前美國食品和藥物管理局(FDA)批準了6種PD-1途徑抑制劑，用于16種腫瘤類型。相反，PD-1缺乏與小鼠的自我耐受性改變和自身免疫性疾病有關。因此，PD-1軸作為治療各種炎癥和自身免疫性疾病的潛在治療靶點受到了廣泛關注
技術路線：

一、PD-1在IL -33激活的ILC2中被高度誘導
    我們首先對PD-1在肺ILC2s上的表達進行了表征，流式細胞術鑒定為CD45+譜系- ST2+ CD127+。在整個研究過程中，未轉染小鼠的ILC2s被定義為naive (nILC2s)， il -33轉染小鼠的ILC2s被定義為activated (aILC2s)。PD-1僅在很少的nILC2s群體中表達;然而，經鼻刺激IL-33可顯著誘導PD-1的表達。我們還評估了PD-L1和PD-L2在肺ilc2上的表達。PD-L1在naive和aILC2s中均高表達，而PD-L2不表達。抑制信號的產生和傳遞需要PD-1與其配體之間的相互作用。為了確定在我們的ilc2依賴性哮喘模型中PD-1配體的潛在來源，我們對PD-L1和PD-L2在CD45+和CD45活肺細胞上的表達進行了表征。
    在CD45+細胞中發(fā)現了兩個陽性群體:(i)同時表達PD-L1和PD-L2的群體，主要代表CD11b+ CD11c+細胞;(ii)僅表達PD-L1的群體，主要代表CD11b+ Gr-1+細胞。有趣的是，在IL-33誘導下，這兩個人群的百分比顯著增加。與此同時，CD45細胞群體也能表達和上調PD-L1的表達，以應對IL-33。
    綜上所述，這些結果表明PD-1對ILC2s具有高度誘導作用，免疫和非免疫肺群體可在ILC2依賴性哮喘中提供PD-1配體來源。

二、PD-1在aILC2s中調節(jié)細胞因子的產生和存活
    PD-1在肺aILC2s中顯著表達，我們使用RNAsequencing分析比較了從野生型(WT)和PD-1敲除(KO)小鼠中經facs分類的aILC2s的轉錄譜。有趣的是，PD-1缺失導致aILC2s中有840個顯著調控基因:426個基因上調，414個基因下調。
    比較了細胞因子編碼基因在中的表達。l5、Il13、Il9和Csf2在沒有PD-1的情況下高度上調(圖2b)。
    WT和PD-1 KO小鼠aILC2s培養(yǎng)24 h，定量培養(yǎng)上清細胞因子。ILC2的激活導致Th2細胞因子的分泌; 然而，PD-1 KO aILC2s顯示出更多的IL-5、IL-13和IL-9(圖2c e)。
    確定PD-L2是否會抑制Th2細胞因子的產生。PD-L2 Fc使IL-5和IL-13的分泌減少了約2- 3倍(圖2f, g)。
    PD-L1的組成性表達是否代表了ILC2s中功能PD-1配體的來源。在沒有PD-1配體來源，以及PD-1阻斷抗體或同型對照的情況下，用IL-33在體外刺激nILC2s。
    PD-1阻斷后，關鍵轉錄因子GATA-3的表達和IL-5的產生顯著增加(圖2h, i)。這些結果表明，在ILC2s中抑制了潛在的PD-1/PD-L1相互作用。
    與WT aILC2s相比，PD-1 KO中Bid、Casp2等促凋亡基因表達明顯下調，而Bcl2l1、Bag3、Mcl1等抗凋亡基因表達上調。
    AnnexinV+ DAPI和雙陽性細胞在PD-1 KO aILC2s中均顯著降低，表明細胞凋亡和死亡減少(圖2k m)。
    流式細胞儀檢測凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達。PD-1 KO aILC2s中Bcl-2的表達顯著且高于WT aILC2s(圖2n, o)。
    綜上所述，這些結果表明PD-1軸積極參與ILC2存活的調控。

三、PD-1的缺乏增強了aILC2s的糖酵解代謝
    有氧糖酵解被認為是T細胞激活和增殖的標志。雖然氨基酸和需氧糖酵解可能對ILC2s31至關重要，但ILC2代謝似乎更依賴于脂肪酸(FA)。
    PD-1缺陷導致糖酵解基因(如Hk1、Pkm和G6pdx)顯著上調，以及FA代謝相關基因的下調。PD-1 KO aILC2s中谷氨酰胺依賴基因也被上調(圖3a)。
    用熒光葡萄糖模擬物2- NBDG和流式細胞術來測量活細胞中葡萄糖摻入的程度。根據轉錄分析，在aILC2s中，PD-1缺失導致葡萄糖攝取增加，提示葡萄糖代謝差異和葡萄糖消耗增加(圖3b)。
    PD-1 KO ILC2s與WT ILC2s相比，在IL-33的作用下，主要的葡萄糖轉運體glut1的表達上調(Supplementary Fig. 2B)。
    代謝組學進一步用于評估PD-1缺乏對代謝產物的影響。PD-1 KO aILC2s與WT aILC2s相比，糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝物水平顯著升高。這些代謝物包括磷酸甘油酸、磷酸正丁糖、磷酸戊糖和磷酸己糖(圖3c f)。
    為了證實不同的2-NBDG攝取和代謝組學結果反映了糖酵解代謝的功能差異，我們測量了耗氧率(OCR)、氧化磷酸化反應(OXPHOS)和細胞外酸化率(ECAR)。PD-1 KO aILC2s表現出備用呼吸能力的下降，說明PD-1的缺乏觸發(fā)了從OXPHOS到有氧糖酵解的轉換(圖3g)。
    在這種情況下，葡萄糖發(fā)酵成乳酸，而不是氧化線粒體由于高能量需求。此外，PD-1 KO的細胞能量表型分析顯示ECAR大于WT aILC2s，這意味著在最大呼吸時OCR/ECAR比值較低，糖酵解能力較高(圖3h, i)。
    這些結果共同揭示了PD-1缺乏與aILC2s中葡萄糖需求增加相關，促使代謝顯著向糖酵解方向轉變

四、PD-1抑制aILC2s中蛋氨酸和谷氨酰胺分解代謝
    氨基酸分解代謝產生蛋白質合成的代謝物，但也可以作為信號分子控制免疫細胞生長、核苷酸合成、氧化還原控制和許多其他功能35。我們的代謝組學分析顯示PD-1的缺乏通常會改變aILC2s的代謝活性。特別是，與嘧啶和嘌呤合成有關的中間代謝物，如5 -二磷酸腺苷(ADP)和腺嘌呤，以及甲基化有關的中間代謝物的上調(圖4a)。
    第一個途徑是蛋氨酸途徑(圖4b)。兩個重要中間代謝物的相對量蛋氨酸代謝,S-Adenosylmethionine (SAM)和SAdenosylhomocysteine (SAH),在PD-1 KO aILC2s顯著增加(圖。4 c, d)。
    兩端蛋氨酸代謝產物的分解代謝,谷胱甘肽和?；撬?表現出更高的相對量PD-1 KO aILC2s WT aILC2s相比(圖4 e, f)。
    在篩選的途徑中，谷氨酰胺分解也受到影響(圖4g)。谷氨酰胺的消耗是關鍵的免疫細胞代謝，特別是淋巴細胞增殖和細胞因子的生產。
    PD-1的缺乏增加了谷氨酰胺代謝中幾個中間產物和末端代謝物的相對水平，如谷氨酸、n -甲基谷氨酸、n -乙酰谷氨酸(NAG)和鳥氨酸(圖4h k)。
    與WT aILC2s相比，只有GABA的相對含量在PD-1 KO中顯著降低(圖4l)。
    綜上所述，這些結果表明PD-1缺乏增強了aILC2s的氨基酸分解代謝，特別是依賴蛋氨酸和谷氨酰胺的代謝途徑。

五、PD-1通過代謝調控抑制aILC2的增殖。
    PD-1缺陷上調了Th2分化信號通路的相關基因，包括Gata-3、Junb、Stat5a和Stat6，下調了參與Th1分化和激活的基因，如Irf1和Stat1(圖5a)。
    根據這些結果，通過流式細胞儀檢測，缺乏PD-1的aILC2s中，GATA-3的表達強度更高(圖5b)。
    Ki67核內染色顯示，在沒有PD-1的情況下，活的aILC2s具有高度增殖能力(圖5c)。為了評估PD-1 KO ILC2s的代謝轉移與增殖之間的因果關系，我們分別使用競爭性抑制劑2-deoxy-d-glucose (2-DG)和cycloleucine (CYL)抑制糖酵解和蛋氨酸分解代謝。2-DG形成不能進行進一步糖酵解的2-DG-6- p，而CYL抑制催化蛋氨酸轉化為SAM的蛋氨酸腺苷轉移酶(MAT)(圖5d)。
    相對較低濃度的這些抑制劑足以顯著降低PD-1 KO aILC2s中GATA-3的表達和增殖，而對WT aILC2s的影響較弱或不顯著(圖5e, f)。
    為了將我們之前的觀察結果與背景相結合，我們研究了體內糖酵解抑制對aILC2s的影響。如圖5g所示，在經鼻注射IL-33的同時，腹腔注射抑制劑2-DG。
    PD-1 KO小鼠肺部ILC2s數量高于WT小鼠。有趣的是，在PD-1 KO小鼠中，2-DG顯著降低了ILC2百分比(CD45+，細胞系細胞)和絕對計數，但在WT小鼠中沒有(圖5h, i)。
    符合這些結果,2 dg治療導致明顯降低GATA-3 PD-1 KO肺aILC2s Ki67的表情,雖然很弱影響WT aILC2s(圖5 j, k)。
    綜上所述,體外和體內實驗表明,PD-1不足與對糖酵解代謝轉變,從而提高ILC2活化和增殖潛力IL-33-induced哮喘

六、ILC2s上PD-1的表達可改善AHR和肺部炎癥
    在最后一次鼻內刺激一天后，使用FinePointe RC系統(tǒng)(Buxco Research Systems)對麻醉的氣管造口小鼠的肺阻力和動態(tài)順應性(cDyn)進行直接測量，然后進行支氣管肺泡灌洗(BAL)和肺組織樣本分析(圖6a)。
    經鼻給予IL-33可顯著增加WT和PD-1 KO小鼠的肺抵抗;然而，il -33處理的PD-1 KO小鼠的肺抵抗力明顯高于il -33處理的WT小鼠(圖6b)。與肺阻力一致的是，il -33處理的PD-1 KO的動態(tài)順應性結果顯示，與il -33處理的WT小鼠相比，其響應更低(圖6c)。
    PD-1是il -33誘導的AHR的負調控因子。雖然IL-33處理顯著誘導WT和PD-1 KO小鼠BAL嗜酸性粒細胞增多，但IL-33處理的PD-1 KO小鼠的嗜酸性粒細胞數量明顯高于WT小鼠(圖)。6 d)。
    同樣，在IL-33刺激后，PD-1 KO小鼠的肺中ILC2s的數量更高，甚至在幼稚小鼠中，IL-5+ IL-13+ ILC2s的數量也更高(圖6e, f)。
    第5天測定AHR、BAL嗜酸性粒細胞和肺ILC2值(圖6g)。
    與對照組相比，抗pd -1處理的Rag2 /小鼠在增加乙酰膽堿濃度、降低動態(tài)順應性、更高的嗜酸性粒細胞招募和更高的肺ILC2數量方面表現出更大的肺抵抗(圖6h k)。

七、PD-1激動劑降低人源化小鼠的ilc2依賴性AHR。
    由于PD-1在自身免疫性疾病和我們的哮喘模型中發(fā)揮有益的調節(jié)作用，我們開發(fā)了一種人類PD-1激動劑，用于靶向AHR中的PD-1+ILC2s。人類ILC2s被鑒定為CD45+譜系CD127+ CRTH2+(圖7a)。
    首先，我們觀察到PD-1在重組人(rh)- IL-2和rh- il -7培養(yǎng)的人ILC2s上表達，并對rh- il33產生重要的誘導反應(圖7b)。
    體外檢測了PD-1激動劑對人ILC2s產生Th2細胞因子的影響。有趣的是，與同型相比，PD-1激動劑強烈抑制了IL-5和IL-13的產生(圖7c, d)。
    在最后三天內，用PBS或rh-IL-33對小鼠進行鼻內刺激以誘導AHR(圖7e)。
    值得注意的是，PD-1激動劑處理的小鼠與同型處理的小鼠相比，肺抵抗顯著降低(圖7f)。
    與肺抵抗一致，PD-1激動劑治療小鼠的動態(tài)順應性表現出更高的反應(圖7g)
    激動劑處理的小鼠肺部炎癥消失，人類ILC2s數量減少，嗜酸性粒細胞減少，氣道上皮厚度減少(圖7h m)。
    總的來說，這些研究首次證實PD-1的激動性激活抑制了IL-33和hdm誘導的哮喘模型中的AHR，并為哮喘性過敏提供了一種新的特異性治療方法。