最佳拍檔之外泌體和miR-375：合力促進(jìn)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化

 骨髓（BM）是神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）轉(zhuǎn)移的主要靶器官，其與患者預(yù)后差有關(guān)，然而，NB細(xì)胞入侵BM的機(jī)制在很大程度上是未知的。腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵因素，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)被認(rèn)為是相關(guān)腫瘤基質(zhì)的基本組成部分。本文發(fā)現(xiàn)從NB的BM受累者中分離出的BM-MSCs比從非浸潤性BM中分離出的MSCs具有更大的成骨潛能。本文于2020年7月發(fā)表在Journal of Extracellular Vesicles（IF:14.976）期刊上。

該文技術(shù)路線如下：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、NB和BM–轉(zhuǎn)移患者來源的BM-MSCs具有較強(qiáng)的成骨能力

提出假設(shè)：BM-MSCs在促進(jìn)NB轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然后驗(yàn)證假設(shè)，從12例感染NB的小孩和7例健康對(duì)照（HC）中分離得到BM-MSC細(xì)胞（Table 1）。與HC-MSCs類似，MBM-和NMBM-MSCs的CD90、CD105、CD81、CD9和GD2檢測(cè)為陽性，CD34、CD45、CD56為陰性(Figure 1(a))。增殖實(shí)驗(yàn)顯示，NMBM-、MBM-和HC-MSCs具有相似的增殖能力。為了檢測(cè)成骨能力進(jìn)行了組織染色和基因表達(dá)。茜素紅染色顯示，成骨誘導(dǎo)21天后，與NMBM-和HC-MSCs相比， MBM-MSCs中鈣離子釋放含量更高(Figure 1(c,d))，并且其成骨分化轉(zhuǎn)錄因子（RUNX2和OSTERIX）和成骨標(biāo)志物（BMP2和SPP1）的表達(dá)也更高；而成脂分化則無顯著差異(Figure 1(e,f))。這些結(jié)果表明與無BM轉(zhuǎn)移患者分離的BM-MSCs相比，NB有BM浸潤患者分離的BM-MSCs具有更強(qiáng)的成骨分化能力。

圖1 MBM-MSCs具有增強(qiáng)的成骨潛能

2、BM轉(zhuǎn)移的NB細(xì)胞系產(chǎn)生的外泌體增強(qiáng)了HC-MSCs的成骨作用

將PKH26標(biāo)記的外泌體與HC-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)，合成脂質(zhì)體作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，外泌體和脂質(zhì)體都被HC-MSCs細(xì)胞內(nèi)化(Figure 2(a,b)，隨后增強(qiáng)了HC-MSCs細(xì)胞中成骨基因的表達(dá)(Figure 2(c))。為了進(jìn)一步探討外泌體對(duì)HC-MSCs細(xì)胞成骨表型的影響，觀察加了不同來源外泌與HC-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)后的鈣釋放情況。結(jié)果顯示，與IMR-32外泌體和脂質(zhì)體相比，SH5YSY來源外泌體共培養(yǎng)的HC-MSCs細(xì)胞具有更多的鈣釋放含量(Figure 2(d,e))。此外，成骨標(biāo)志物的表達(dá)不僅在成骨培養(yǎng)基中高表達(dá)在SH5YSY來源外泌體誘導(dǎo)組中也高表達(dá)(Figure 2(f,g))。這些結(jié)果表明BM轉(zhuǎn)移性來源的NB細(xì)胞的外泌體在調(diào)節(jié)BM-MSCs的成骨分化中扮演著重要的作用。

圖2 從MBM細(xì)胞中分離的外泌體可誘導(dǎo)HC-MSCs的成骨分化

3、MiR-375在從BM -轉(zhuǎn)移來源的NB細(xì)胞系釋放的外泌體和MBM-MSCs中高表達(dá)

如圖3所示，對(duì)7中細(xì)胞系來源的外泌體中miRNA進(jìn)行表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體miR-375的表達(dá)在PT來源的細(xì)胞系和BM來源的細(xì)胞系之間存在差異，miR-375顯著高表達(dá)，在BM -轉(zhuǎn)移來源的NB細(xì)胞系更是顯著上調(diào)。

圖3 外泌體miR-375的表達(dá)在PT來源的細(xì)胞系和BM來源的細(xì)胞系之間存在差異

隨后，靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)YAP1和DEPTOR是miR-375的靶基因(Figure 4(a))，其表達(dá)水平在NB細(xì)胞系中存在差異，與PT來源細(xì)胞系相比，在NB BM轉(zhuǎn)移細(xì)胞中顯著低表達(dá)，而相比于IMR32IGR-NB8，YAP1蛋白和YAP1-p幾乎不在NB BM轉(zhuǎn)移細(xì)胞中表達(dá)(Figure 4(b-c))。此外，經(jīng)過SH5YSY來源外泌體處理過的HC-MSCs細(xì)胞中YAP1和DEPTOR的表達(dá)都顯著上調(diào)了(Figure 4(f-g))。這種miR-375靶基因表達(dá)的可變性可能與樣本數(shù)量少有關(guān)也可能與參與其中的分子途徑有關(guān)。

圖4 從SHSY5Y中分離的外泌體下調(diào)了YAP1和DEPTOR這兩個(gè)miR-375的靶基因

4、miR-375調(diào)節(jié)成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

作者首先檢測(cè)了NMBM-MSCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-375后24h-96h不同時(shí)段的miR-375的表達(dá)和靶基因YAP1和DEPTOR表達(dá)。如預(yù)期的，miR-375的表達(dá)升高，YAP1和DEPTOR的表達(dá)下降，此外，成骨標(biāo)志物SPP1和OSTERIX的表達(dá)也升高了(Figure 5(a-d))。與此相反的，轉(zhuǎn)染miR-375 抑制劑后得到的效果與上述完全相反(Figure 5(e-g))?？傊贜MBM-MSCs中，miR-375過表達(dá)可誘導(dǎo)成骨基因的轉(zhuǎn)錄。

圖5 在NMBM-MSCs中，miR-375過表達(dá)可誘導(dǎo)成骨基因的轉(zhuǎn)錄

5、MiR-375表達(dá)水平與NB患者的BM疾病相關(guān)

為了檢測(cè)miR-375表達(dá)水平與NB患者的BM浸潤的相關(guān)性，檢測(cè)了有無BM浸潤的患者中miR-375的表達(dá)，結(jié)果顯示MBM患者及其外泌體中的miR-375表達(dá)均顯著高于NMBM患者 (Figure 6(a-b))。為了評(píng)估m(xù)iR-375在BM細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)行了27例NMBM患者和33例MNM患者的石蠟包埋BM樣本的ISH染色。而突觸素染色用于評(píng)估NB侵襲。染色強(qiáng)度miR-375無表達(dá)記0分，低表達(dá)1分，高表達(dá)記2分，如圖Figure 6(c)。結(jié)果顯示，1分和2分顯著與BM浸潤患者相關(guān)(Figure 6(d,e))。miR-375在MBM患者中的表達(dá)不僅存在于神經(jīng)原細(xì)胞中，也存在于成骨細(xì)胞和BM的其他原生細(xì)胞中(Figure 6(f))。Figure 6(g)表明PKH26標(biāo)記的SHSY5Y來源外泌體可以被BM細(xì)胞吸收，并且可以轉(zhuǎn)運(yùn)攜帶的miR-375(Figure 6(h-i))。這些結(jié)果表明循環(huán)外泌體和BM中高水平的miR-375與BM的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖6 NB患者中MiR-375的表達(dá)與BM疾病相關(guān)

總之，本文發(fā)現(xiàn)在與骨NB來源的外泌體共培養(yǎng)后，miR-375在MBM-MSCs和HC-MSCs中的表達(dá)水平升高。基于這些結(jié)果，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-375可能通過外泌體從BM型NB細(xì)胞轉(zhuǎn)移到間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)成骨分化，并為轉(zhuǎn)移生長創(chuàng)造有利的微環(huán)境(Figure6(f))。

參考文獻(xiàn)：

Colletti Marta., Tomao Luigi., Galardi Angela., Paolini Alessandro., Di Paolo Virginia., De Stefanis Cristiano., Mascio Paolo., Nazio Francesca., Petrini Stefania., Castellano Aurora., Russo Ida., Caruso Roberta., Piga Simone., De Vito Rita., Pascucci Luisa., Peinado Hector., Masotti Andrea., Locatelli Franco., Di Giannatale Angela.(2020). Neuroblastoma-secreted exosomes carrying miR-375 promote osteogenic differentiation of bone-marrow mesenchymal stromal cells. J Extracell Vesicles, 9(1), 1774144. doi:10.1080/20013078.2020.1774144