lncRNA與免疫抑制微環(huán)境的研究思路

   導(dǎo)語(yǔ)：腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，主要由細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分組成，共同構(gòu)成了復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。免疫抑制微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境中起抑制免疫功能的部分，其組成包括免疫抑制性細(xì)胞和抑制性細(xì)胞因子。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）已被報(bào)道參與腫瘤進(jìn)展，lncRNA與免疫抑制微環(huán)境研究思路值得關(guān)注。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. LINC00301在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中高表達(dá)，提示預(yù)后不良

   通過(guò)匯編癌細(xì)胞系百科全書(CCLE)以及細(xì)胞系、組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00301在NSCLC細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)。評(píng)價(jià)LINC00301的臨床意義，發(fā)現(xiàn)LINC00301與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤大小密切相關(guān)，高LINC00301水平與較差的總體生存期相關(guān)，LINC00301高表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。

2. LINC00301在體外加速細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移/侵襲，抑制細(xì)胞周期阻滯/細(xì)胞凋亡

   探索LINC00301在NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。在4種NSCLC細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)LINC00301，進(jìn)行克隆形成試驗(yàn)、CCK8、臺(tái)盼藍(lán)染色和BrdU染色。結(jié)果表明，LINC00301可顯著加速NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移和侵襲。沉默LINC00301有利于細(xì)胞周期停滯和凋亡。

3. LINC00301在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)Treg細(xì)胞浸潤(rùn)

   用A549和SPC-A-1細(xì)胞建立了BALB/c裸鼠異種移植模型，LINC00301 敲低鼠的腫瘤體積和重量顯著受到抑制，LINC00301顯著加速了人NSCLC細(xì)胞在小鼠模型中的致瘤能力。腫瘤免疫環(huán)境廣泛參與包括NSCLC在內(nèi)的不同癌癥類型的腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲低LINC00301細(xì)胞對(duì)C57BL/6J小鼠分離的腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的作用，分離腫瘤，消化成單細(xì)胞后應(yīng)用22種抗體進(jìn)行CyTOF分析，發(fā)現(xiàn)LINC00301 過(guò)表達(dá)組表現(xiàn)出較高的CD4 + CD25 + Treg細(xì)胞浸潤(rùn)和較低的CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)，表明LINC00301通過(guò)募集Treg細(xì)胞在NSCLC中發(fā)揮免疫抑制作用。

 
4. 轉(zhuǎn)錄因子(TF)FOXC1，并不是甲基化和去乙?；{(diào)節(jié)NSCLC中LINC00301表達(dá)

  探索LINC00301的調(diào)節(jié)因子，染色質(zhì)甲基化和去乙?；赡艹聊蚣せ罨虮磉_(dá)。通過(guò)在線軟件MethPrimer和DBCAT分析LINC00301啟動(dòng)子，未發(fā)現(xiàn)CpG島；細(xì)胞沉默DNA(cytosine-5)-甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)DNMT1不會(huì)顯著影響LINC00301的表達(dá)，表明DNA甲基化不參與NSCLC細(xì)胞中LINC00301的上調(diào)。在細(xì)胞中阻礙HDAC1后，LINC00301水平未增強(qiáng)，表明去乙?；粎⑴cNSCLC中LINC00301的上調(diào)。沉默組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2不會(huì)顯著影響LINC00301的表達(dá)，表明組蛋白甲基化不參與NSCLC細(xì)胞中LINC00301的上調(diào)。綜上所述，甲基化和去乙?；粎⑴cNSCLC中LINC00301的上調(diào)。

  為進(jìn)一步確定LINC00301的上游，通過(guò)JARSPAR在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能與LINC00301啟動(dòng)子相互作用的潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)在NSCLC中上調(diào)的FOXC1。沉默F(xiàn)OXC1顯著促進(jìn)LINC00301下調(diào)。為證實(shí)LINC00301是FOXC1的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，將LINC00301啟動(dòng)子的片段序列克隆到pGL3-basic載體中，轉(zhuǎn)染HEK-293 T細(xì)胞后測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)熒光素酶活性是-1395到-882 nt和-2000到-1395 n，表明含有調(diào)控元件的兩個(gè)片段對(duì)LINC00301轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。FOXC1 敲低顯著降低了-1395到-882 nt片段的熒光素酶活性，表明LINC00301啟動(dòng)子上-1395至-882 nt的區(qū)域負(fù)責(zé)foxc1誘導(dǎo)的LINC00301活化。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOXC1可以直接結(jié)合NSCLC細(xì)胞系中LINC00301啟動(dòng)子上的位點(diǎn)6（-1395到-1388 nt）。以上結(jié)果顯示，在NSCLC中，LINC00301上調(diào)確實(shí)是由FOXC1介導(dǎo)的。

5. LINC00301通過(guò)PRC2正向控制H3K27三甲基化

   為闡明LINC00301調(diào)控NSCLC細(xì)胞的分子機(jī)制，首先評(píng)估了LINC00301在NSCLC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。FISH鑒定LINC00301位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，但細(xì)胞核中LINC00301的比例遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)中的比例。因此，懷疑LINC00301可能通過(guò)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)途徑作為癌基因發(fā)揮作用。

組蛋白甲基化與NSCLC進(jìn)展過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組重編程有關(guān)。NSCLC細(xì)胞中LINC00301缺陷特異性地降低了H3K27的二甲基化和三甲基化，而不影響H3K9位點(diǎn)的二甲基化和三甲基化水平。這些表明LINC00301在NSCLC中對(duì)H3K27甲基化有特異性正調(diào)控。H3K27的二甲基化和三甲基化一般是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)催化的，RIP試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在A549和SPC-a-1細(xì)胞中，LINC00301在與PRC2元件EZH2和SUZ12的相互作用組中顯著富集。使用鏈霉親和素偶聯(lián)微珠進(jìn)行RNA下拉試驗(yàn)驗(yàn)證生物素化的LINC00301在NSCLC細(xì)胞中與EZH2結(jié)合。

6. LINC00301和EZH2之間的相互作用

   為確定LINC00301與EZH2蛋白哪個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)域圖譜分析顯示LINC00301直接與EZH2的612–727 aa區(qū)域結(jié)合。體外RNA下拉實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LINC00301的包含83-123 nt基序序列，結(jié)合并受EZH2保護(hù)。消除LINC00301的這個(gè)序列可消除其與EZH2的相互作用。RNA EMSA發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞純化的LINC00301與重組EZH2之間形成復(fù)合物。因此得出結(jié)論，LINC00301通過(guò)特定區(qū)域直接與EZH2結(jié)合。

7. LINC00301招募EZH2并介導(dǎo)EAF2啟動(dòng)子H3K27me3抑制EAF2轉(zhuǎn)錄

    H3K27的三甲基化是由EZH2催化的。LINC00301的沉默顯著增加了細(xì)胞中EZH2的靶抑制基因EAF2 mRNA和蛋白水平，EZH2沉默顯著增加細(xì)胞中EAF2的mRNA和蛋白水平。因此，LINC00301通過(guò)直接與EZH2結(jié)合介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中EAF2啟動(dòng)子H3K27me3來(lái)抑制EAF2的表達(dá)。

8. LINC00301通過(guò)調(diào)節(jié)EAF2/VHL/HIF1α通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移/侵襲
   腫瘤抑制因子EAF2在腫瘤中下調(diào)，文獻(xiàn)報(bào)道EAF2可結(jié)合并穩(wěn)定pVHL，進(jìn)而促進(jìn)HIF1α降解。因此，EAF2可能是EZH2上調(diào)和HIF1α活化之間的關(guān)鍵連接因子。為證明這一假設(shè)，敲低LINC00301，發(fā)現(xiàn)顯著增加EAF2和pVHL蛋白表達(dá)，降低HIF1α蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)有相反效果。隨后檢測(cè)LINC00301/EAF2通路在NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，LINC00301 敲低和EAF2過(guò)表達(dá)阻礙細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

9. LINC00301通過(guò)海綿miR-1276激活HIF1α發(fā)揮致癌作用

   鑒于LINC00301位于細(xì)胞核（初級(jí)）和細(xì)胞質(zhì)（次級(jí)），推測(cè)LINC00301也可能通過(guò)細(xì)胞質(zhì)途徑發(fā)揮其致癌作用。LncRNA可能作為ceRNA調(diào)控miRNA的生物學(xué)效應(yīng)。探索與LINC00301相關(guān)的特異性miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-1276是與LINC00301結(jié)合的最富集的miRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步確定LINC00301與miR-1276的結(jié)合。數(shù)據(jù)庫(kù)miRanda和PicTar篩選miR-1276的潛在靶標(biāo)-癌基因HIF1α，雙熒光素酶受體試驗(yàn)以驗(yàn)證miR-1276調(diào)控HIF1α。在NSCLC樣本中，HIF1A mRNA水平與miR-1276表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性，miR-1276不影響HIF1A mRNA表達(dá)水平，但抑制HIF1A蛋白表達(dá)水平。這表明miR-1276在轉(zhuǎn)錄后水平影響HIF1α蛋白表達(dá)。

研究LINC00301/miR-1276/HIF1α軸在NSCLC細(xì)胞增殖和遷移/侵襲中的功能。臺(tái)盼藍(lán)染色、克隆形成、遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)證明miR-1276模擬物抑制生長(zhǎng)/遷移/侵襲，HIF1A 過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)用miR-1276模擬物加HIF1A 過(guò)表達(dá)處理細(xì)胞時(shí)，miR-1276逆轉(zhuǎn)了HIF1A在細(xì)胞增殖/遷移和侵襲中的作用，HIF1A 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-1276的生長(zhǎng)抑制功能。這些結(jié)果證明miR1276通過(guò)直接靶向HIF1A mRNA的3’-UTR來(lái)調(diào)控細(xì)胞遷移/侵襲。因此，LINC00301的致癌效率部分歸因于海綿miR-1276，然后觸發(fā)NSCLC中的HIF1α。

總結(jié)：1. LINC00301在NSCLC中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤(rùn)，抑制CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)；

    2. 轉(zhuǎn)錄因子FOXC1調(diào)節(jié)LINC00301在NSCLC中的表達(dá)；

    3. LINC00301通過(guò)與EZH2直接結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞核中EAF2的表觀遺傳沉默，介導(dǎo)HIF1α的活化，部分介導(dǎo)致癌作用；

    4. LINC00301通過(guò)作為miR-1276的ceRNA增加NSCLC細(xì)胞質(zhì)中HIF1α的表達(dá)，介導(dǎo)致癌作用。