外泌體miR92a-3p-肝癌治療的靶點(diǎn)

  外泌體在肝細(xì)胞癌（HCC）的細(xì)胞間通訊和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。然而，不同轉(zhuǎn)移潛能的異質(zhì)性肝癌細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊以及由此導(dǎo)致的癌癥進(jìn)展在HCC中尚不完全清楚。今天小編為大家介紹發(fā)表于影響因子為7.97的“Oncogene”上的文章“High-metastatic cancer cells derived exosomal miR92a-3p promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis of low-metastatic cancer cells by regulating PTEN/Akt pathway in hepatocellular carcinoma”，帶大家了解這其中的奧秘。
  

在本文研究中，我們通過(guò)對(duì)具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞（MHCC-97H和97hm）進(jìn)行外泌體miRNA測(cè)序，確定了miR-92a-3p為肝癌進(jìn)展的潛在標(biāo)志物。外源性miR-92a-3p通過(guò)靶向PTEN并調(diào)節(jié)其下游Akt/Snail信號(hào)，促進(jìn)受體癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。此外，通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞的mRNA測(cè)序，預(yù)測(cè)miR92a-3p的潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1和c-Myc通過(guò)直接結(jié)合其宿主基因miR17HG的啟動(dòng)子促進(jìn)細(xì)胞和外泌體miR-92a-3p的表達(dá)。最后臨床資料顯示，高血漿miR92a-3p水平與肝癌患者總生存率和無(wú)病生存率相關(guān)，提示HCC患者預(yù)后不良。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系（97hm和Huh7）的構(gòu)建

異質(zhì)性普遍存在于癌癥的許多方面，包括增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性。首先，為了確定肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移異質(zhì)性，用遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了5種肝癌細(xì)胞的遷移能力，確定了Huh7和SK-Hep-1肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。為了確定EVs是否能將轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)傳遞給癌細(xì)胞，我們分離了Huh7和SK細(xì)胞來(lái)源的外泌體，并分別用于治療97h和Huh7細(xì)胞。用外泌體處理的細(xì)胞，尤其是高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，遷移比陰性對(duì)照細(xì)胞更具侵略性（圖1a，b）接著，通過(guò)對(duì)97 h和Huh7細(xì)胞持續(xù)施加選擇性進(jìn)化壓力，從原代細(xì)胞中獲得高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞（97 hm和Huhm）（圖1c）。與親代細(xì)胞相比，97hm和Huhm的遷移能力顯著增強(qiáng)（圖1d-f）。從western blot的結(jié)果來(lái)看，高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞（97hm和Huhm）的間充質(zhì)相關(guān)蛋白（N-鈣粘蛋白、波形蛋白、β-連環(huán)蛋白和Snail）的表達(dá)高于其親代低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞（97h和Huh7）（圖1g）。

2）miR92a-3p促進(jìn)肝癌的侵襲性和惡性程度
   miR92a-3p促進(jìn)肝癌的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。然而，miR92a-3p在肝癌中的確切作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR92a-3p下調(diào)時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展在體內(nèi)被顯著抑制（圖4a-c）。此外，上調(diào)miR92a-3p促進(jìn)了97h和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖4d，e）。增加細(xì)胞活動(dòng)性是腫瘤侵襲的基本步驟，伴隨著細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。在肝癌細(xì)胞中，miR92a-3p過(guò)表達(dá)組中觀察到更多的微管和微絲（圖4f）。然后，為了確定miR-92a-3p在肝癌演變中的作用，我們轉(zhuǎn)染miR-92a-3p抑制劑降低miR-92a-3p的表達(dá)（圖4k）。如圖4g所示，97hm和Huhm比97h和Huh7細(xì)胞具有更高的遷移和侵襲能力，并且增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力由于97hm和Huhm細(xì)胞中miR-92a-3p的下調(diào)而降低（圖4g）。接下來(lái)，我們想探討miR92a-3p是否影響肝癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。為了達(dá)到這個(gè)目的，我們用高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系（97hm）構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移模型。同時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射抗miR92a-3p抗原。我們的結(jié)果顯示miR92a-3p的下調(diào)抑制了HCC的轉(zhuǎn)移（圖4h-j）。

3）在高轉(zhuǎn)移性肝癌的外泌體中檢測(cè)到高水平的miR-92a-3p

為了確定外泌體中哪些RNA作為主要的惡性信息，我們對(duì)來(lái)自97h細(xì)胞及其進(jìn)化的97hm細(xì)胞的外泌體RNA樣品進(jìn)行miRNA測(cè)序。結(jié)果表明，與97h外泌體相比，97hm外泌體中627個(gè)miRNA上調(diào)。圖3a描繪了差異表達(dá)最多的miRNA的熱圖。其中，miR92a-3p是差異表達(dá)最豐富的miRNA（圖3b）。此外，通過(guò)qRT-PCR，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系（97hm和Huhm）中細(xì)胞和外泌體miR92a-3p水平高于兩個(gè)“正常”HCC細(xì)胞系（97h和Huh7）（圖3d）。與陰性對(duì)照組相比，97h和Huh7細(xì)胞的miR92a-3p表達(dá)顯著增加（圖3e）。

為了確定這些miRNAs作為預(yù)后標(biāo)志物的潛在作用，我們檢測(cè)了這些miRNA在HCC患者血漿外泌體中的表達(dá)。HCC患者源性異種移植（PDX）小鼠模型的血漿外泌體miR92a-3p顯著高于正常小鼠（圖3f-h）。接下來(lái)，為了闡明miR92a-3p在轉(zhuǎn)移中的潛在作用，建立了三種肝癌小鼠模型：第1組；陰性對(duì)照組，第2組；皮下HCC異種移植（無(wú)肺轉(zhuǎn)移）和第3組；原位HCC異種移植（有肺轉(zhuǎn)移）（圖3i，j）。與第1組相比，皮下肝癌小鼠血漿中的外泌體miR92a-3p略有增加，而轉(zhuǎn)移瘤小鼠（第3組）血漿中miR92a-3p顯著增加（圖3k）。這些結(jié)果表明，在體外和體內(nèi)，miR92-3p的表達(dá)隨著肝癌的發(fā)展而增加，因此，miR92a-3p可能是肝癌進(jìn)展的有效標(biāo)志。

4）miR92a-3p促進(jìn)肝癌的侵襲性和惡性程度

miR92a-3p促進(jìn)肝癌的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。然而，miR92a-3p在肝癌中的確切作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR92a-3p下調(diào)時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展在體內(nèi)被顯著抑制（圖4a-c）。此外，上調(diào)miR92a-3p促進(jìn)了97h和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖4d，e）。增加細(xì)胞活動(dòng)性是腫瘤侵襲的基本步驟，伴隨著細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。在肝癌細(xì)胞中，miR92a-3p過(guò)表達(dá)組中觀察到更多的微管和微絲（圖4f）。然后，為了確定miR-92a-3p在肝癌演變中的作用，我們轉(zhuǎn)染miR-92a-3p抑制劑降低miR-92a-3p的表達(dá)（圖4k）。如圖4g所示，97hm和Huhm比97h和Huh7細(xì)胞具有更高的遷移和侵襲能力，并且增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力由于97hm和Huhm細(xì)胞中miR-92a-3p的下調(diào)而降低（圖4g）。接下來(lái)，我們想探討miR92a-3p是否影響肝癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。為了達(dá)到這個(gè)目的，我們用高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系（97hm）構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移模型。同時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射抗miR92a-3p抗原。我們的結(jié)果顯示miR92a-3p的下調(diào)抑制了HCC的轉(zhuǎn)移（圖4h-j）。

5）miR92a-3p通過(guò)靶向PTEN調(diào)節(jié)Akt/Snail途徑促進(jìn)EMT

腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生與癌細(xì)胞內(nèi)的EMT密切相關(guān)。我們想探討miR92a-3p是否參與了肝癌EMT的調(diào)控。正如預(yù)期的那樣，miR92a-3p的過(guò)表達(dá)增加了間充質(zhì)生物標(biāo)記物（N-cadherin、β-catenin、Snail）的表達(dá)，同時(shí)降低了E-cadherin的蛋白質(zhì)水平（圖5a，b）。為了確定miR92a-3p的靶點(diǎn)，利用miRDB、miRWalk、TargetScan和miRTarBase四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR92a-3p的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，PTEN下降最明顯（圖5c）。western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白的表達(dá)在miR92a-3p過(guò)表達(dá)后顯著降低。因此，可以推斷miR-92-3p下調(diào)了肝癌中PTEN的表達(dá)。然后，我們構(gòu)建了含有3’-UTRd的PTEN mRNA的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)（圖5d）。結(jié)果顯示miR92a-3p直接與PTEN 3’UTR相互作用，降低PTEN的表達(dá)（圖5d）。通過(guò)Western blot，我們發(fā)現(xiàn)miR92a-3p抑制PTEN的表達(dá)，然后上調(diào)磷酸化Akt、磷酸化mTOR和磷酸化GSK-3β（圖5e）。最后，我們發(fā)現(xiàn)AntigomiR-92a-3p減少了由外泌體引起的肝癌轉(zhuǎn)移（圖5f）。

6）miR92a-3p抑制和PTEN過(guò)表達(dá)可中和高轉(zhuǎn)移性HCC源性外泌體介導(dǎo)的EMT

我們發(fā)現(xiàn)一旦PTEN被質(zhì)粒過(guò)表達(dá)（圖6a），miR92a-3p過(guò)表達(dá)引起的HCC中增強(qiáng)的遷移和侵襲能力會(huì)恢復(fù)到正常水平（圖6b）。western blot結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)染PTEN高表達(dá)質(zhì)粒后，PTEN和Ecadherin的下調(diào)和磷酸化Akt和Snail的上調(diào)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平（圖6c）。其次，為了闡明miR-92a3p在體內(nèi)是否影響PTEN/Akt通路，采用皮下腫瘤異種移植模型。結(jié)果表明97hm外泌體治療促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，這種促進(jìn)作用被AntigomiR-92a-3p的治療中和（圖6d，e）。免疫組化結(jié)果顯示在高轉(zhuǎn)移性肝癌源性外泌體治療后，PTEN表達(dá)降低，磷酸化Akt和Snail蛋白水平上調(diào)。然而，一旦腫瘤移植物中的miR92a-3p被antigomiR92a-3p中和，PTEN、p-Akt和Snail水平則在體內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平（圖6f）。提示miR92a-3p通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/Akt通路促進(jìn)EMT，在HCC的轉(zhuǎn)移中起重要作用。

7）轉(zhuǎn)錄因子E2F1和c-Myc促進(jìn)miR-92a-3p的表達(dá)

為了確定可能導(dǎo)致miR92a-3p上調(diào)的TFs，在97h細(xì)胞和97hm細(xì)胞之間進(jìn)行mRNA測(cè)序（圖7a）。結(jié)合mRNA測(cè)序結(jié)果與JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)37個(gè)候選基因可能直接促進(jìn)miR92a-3p的表達(dá)（圖7b）。經(jīng)GSEA分析后，發(fā)現(xiàn)與97h細(xì)胞相比，在97hm細(xì)胞中E2F1和c-Myc相關(guān)的途徑顯著富集（圖7c）。此外，與97H和Huh7相比，97H和Huhm中這兩種TFs的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)也增加（圖7d，e）。E2F1和c-Myc的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞中miR17-92簇中miR92a-3p和其他成員的表達(dá)（圖7f，g）。為了驗(yàn)證miR-92a-3p的宿主基因miR17HG啟動(dòng)子中c-Myc結(jié)合位點(diǎn)（cbs）和E2F1結(jié)合位點(diǎn)（EBSs），我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析。如圖7h所示，有三個(gè)cbs和兩個(gè)ebs；CBS1和EBS1通過(guò)Southern blot試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)（圖7i）。然后，我們構(gòu)建miR92啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)，并與E2F1和c-Myc高表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染97h細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)熒光素酶活性。如圖7j所示，E2F1和c-Myc都能激活miR92a-3p的表達(dá)，說(shuō)明E2F1和c-Myc直接結(jié)合miR17HG的特異性DNA序列，促進(jìn)miR92a-3p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。

8）miR-92a-3p水平與HCC肺轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展相關(guān)

為探討miR92a-3p在HCC患者中的作用，采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR92a3p在肝癌組織及癌周組織中的表達(dá)。如圖8a所示，與癌周組織相比，在肝癌組織中miR92a-3p升高，這與來(lái)自GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)一致（圖8b）。更重要的是，與無(wú)血管侵犯的肝癌組織相比，有血管侵犯的肝癌組織中miR-92a-3p水平更高（圖8a）。其次，我們檢測(cè)了42例HCC患者（21例無(wú)轉(zhuǎn)移，21例有轉(zhuǎn)移）血漿中miR-92a-3p的表達(dá)。有轉(zhuǎn)移的肝癌患者血漿中miR-92a-3p的水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的HCC患者（圖8c）。為了進(jìn)一步了解miR92a-3p表達(dá)與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系，我們收集了原發(fā)性肝癌患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本，并用其檢測(cè)外泌體miR92a-3p的表達(dá)。如圖8d所示，通過(guò)手術(shù)切除腫瘤后，外泌體miR92a-3p水平降低。根據(jù)血漿miR92a-3p的水平將肝癌患者分為兩組（miR92a-3p高表達(dá)組和miR92a-3p低表達(dá)組），miR92a-3p高表達(dá)與總生存率低、無(wú)病生存率差相關(guān)，提示HCC患者預(yù)后差（圖8e）。此外，無(wú)轉(zhuǎn)移的肝癌患者與有轉(zhuǎn)移的肝癌患者相比，外泌體miR92a-3p的AUCROC為0.8534（圖8f）。綜上所述，miR-92a-3p在高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞和有轉(zhuǎn)移的肝癌患者中過(guò)表達(dá)。HCC來(lái)源的外泌體miR-92a-3p通過(guò)介導(dǎo)PTEN的降低和激活A(yù)kt/Snail信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)EMT和HCC的轉(zhuǎn)移，將“正?！钡腍CC細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更具侵襲性的HCC細(xì)胞（圖8g）。

    結(jié)論：肝源外泌體miR92a-3p通過(guò)抑制PTEN和激活A(yù)kt/Snail信號(hào)通路，在EMT進(jìn)展和促進(jìn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體miR92a-3p是一種潛在的預(yù)測(cè)HCC轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。這一認(rèn)識(shí)可能會(huì)促進(jìn)針對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的新的治療和預(yù)防策略的發(fā)展。