不要再晝夜顛倒了 可能會(huì)得結(jié)腸炎

   潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病統(tǒng)稱(chēng)為炎癥性腸病(IBDs)，是一種全球性疾病，在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率很高(0.3%)，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率正在迅速升高，導(dǎo)致大量的醫(yī)療保健費(fèi)用和工作生產(chǎn)力的損失。本文發(fā)現(xiàn)了由循環(huán)和NF-κB驅(qū)動(dòng)的lncRNA（Lnc-UC）通過(guò)表觀遺傳修飾了生物鐘基因Rev-erbα的轉(zhuǎn)錄，從而將生物鐘與結(jié)腸炎聯(lián)系起來(lái)。本文于2020年10月發(fā)表于《Science Advances》IF：13.116。

技術(shù)路線如下：

該文主要結(jié)果如下：

1、Lnc-UC是一個(gè)循環(huán)和大腸桿菌相關(guān)的lncRNA

結(jié)腸炎和正常小鼠RNA測(cè)序，篩選到197個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中有28個(gè)是循環(huán)相關(guān)的，包括Lnc-UC (ENSMUST00000124503.1)（圖1A-C）。Lnc-UC的表達(dá)具有明顯的晝夜性，在ZT10時(shí)顯著高表達(dá)，原位雜交(CISH)證實(shí)了小鼠結(jié)腸中存在Lnc-UC，且在其它組織中也存在表達(dá)，包括肺、心、腦、腎、腹膜巨噬細(xì)胞（PMs）等（圖1D-F）。Lnc-UC主要分布于結(jié)腸細(xì)胞和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDMs）的細(xì)胞核中（圖1G-H）。

2、NF-κB驅(qū)動(dòng)結(jié)腸炎小鼠表達(dá)Lnc-UC

KEGG揭示結(jié)腸炎與NF-κB通路及其相關(guān)通路的激活有關(guān)，如NF-κB靶向基因Ptgs2，IL-1β和Cxcl2的表達(dá)升高（圖2A-B）。無(wú)論是BMDMs中還是血漿BMDMs 或者PMs中Lnc-UC的表達(dá)與LPS誘導(dǎo)的劑量和時(shí)間有依賴(lài)性（圖C-F）。此外，重組Tnfα蛋白（NF-κB激活劑）和p65（NF-κB亞基）的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒都能誘導(dǎo)BMDMs中Lnc-UC的表達(dá)，而JSH-23（NF-κB抑制劑）則抑制Lnc-UC的表達(dá)（圖2G-I）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)鑒定到兩個(gè)Lnc-UC啟動(dòng)子與p65結(jié)合的區(qū)域，而重組Tnfα蛋白增強(qiáng)了p65募集至結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。總之，NF-κB驅(qū)動(dòng)Lnc-UC的表達(dá)通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制。

圖2 NF-κB驅(qū)動(dòng)結(jié)腸炎小鼠表達(dá)Lnc-UC

3、Lnc-UC在體外調(diào)節(jié)炎癥

將Lnc-UC過(guò)表達(dá)和對(duì)照的BMDMs細(xì)胞用于RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Lnc-UC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化（圖3A-B）。通過(guò)獲得與缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc-UC是NF-κB靶向基因（包括Nlrp3, IL-6, Tnfα, IL-1β, and IL-18)）的負(fù)調(diào)節(jié)劑（圖3C-D）。Lnc-UC敲除誘導(dǎo)的NF-κB靶向基因表達(dá)的改變可以通過(guò)Lnc-UC過(guò)表達(dá)恢復(fù)，表明Lnc-UC對(duì)NF-κB有特殊的作用（圖3E）。與此一致，Lnc-UC抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性（圖3F-G）。這表明Lnc-UC在NF-κB信號(hào)和炎癥中扮演抑制作用。

圖3 Lnc-UC作為炎癥調(diào)節(jié)因子

4、Lnc-UC消融使小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎敏感

作者構(gòu)建了Lnc-UC敲除小鼠（Lnc-UC^?/?），然后和WT鼠一起藥物誘導(dǎo)發(fā)生實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，結(jié)果顯示Lnc-UC^?/?小鼠對(duì)結(jié)腸炎的敏感性增加，體重丟失更大，疾病活性指標(biāo)更高，結(jié)腸更短（圖3H-K）。并且，Lnc-UC^?/?小鼠結(jié)腸炎病理更嚴(yán)重，此外，其預(yù)后與晝夜節(jié)律性顯著相關(guān)（圖3L-P）?？傊@些結(jié)果表明Lnc-UC調(diào)節(jié)小鼠晝夜性結(jié)腸炎。
          Lnc-UC調(diào)節(jié)生物鐘基因Rev-erbα和炎癥。Lnc-UC缺失導(dǎo)致生物鐘基因表達(dá)中斷，特別是Rev-erbα（圖4A-B）。據(jù)報(bào)道Rev-erbα通過(guò)NF-κB信號(hào)通路和Nlrp3炎性小體參與生物鐘和結(jié)腸炎的調(diào)節(jié)。因此探究其在Lnc-UC炎性機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Rev-erbα導(dǎo)致免疫響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)改變，敲除Rev-erbα則導(dǎo)致炎性分子表達(dá)上調(diào)（圖4C-D）。作者觀察到，在BMDMs中，Lnc-UC和Rev-erbα相關(guān)的炎癥富集通路高度重疊（圖4E）。此外，Lnc-UC減少了Rev-erbα靶基因Nlrp3的表達(dá)，而這種抑制作用在Rev-erbα敲除小鼠中不存在（圖4F）。由于RIP顯示Lnc-UC和Rev-erbα不存在相互作用（圖4G），所以作者進(jìn)一步探究了其作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Lnc-UC導(dǎo)致細(xì)胞中Rev-erbα表達(dá)升高但是其靶基因Bmal1的表達(dá)減少，敲除則相反（圖4H-I）。這些數(shù)據(jù)表明Lnc-UC獲得的抗炎效果可能通過(guò)調(diào)節(jié)Rev-erbα的表達(dá)。

圖4 Lnc-UC調(diào)節(jié)生物鐘基因Rev-erbα和炎癥

5、Lnc-UC通過(guò)與Cbx1相互作用，表觀遺傳調(diào)控Rev-erbα

Lnc-UC包括4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能用于靶向調(diào)控其它蛋白，實(shí)驗(yàn)表明Cbx1作為一個(gè)核蛋白可以與Lnc-UC相互作用（圖5A-E）。結(jié)合位點(diǎn)位于1-74nt和326-432nt片段區(qū)域，一旦該區(qū)域突變，則不能調(diào)控Rev-erbα的表達(dá)和抑制炎癥反應(yīng)（圖5F）。Lnc-UC敲除增強(qiáng)了H3K9的三甲基化，增加了對(duì)Rev-erbα的表觀遺傳調(diào)控的可能性（圖5G）。ChIP實(shí)驗(yàn)顯示Cbx1，Suv39h1和H3K9me3在Rev-erbα啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集，而Lnc-UC敲除增強(qiáng)了這種富集作用（圖5H）。此外，Cbx1敲除則減少了H3K9me3在Rev-erbα啟動(dòng)子區(qū)域富集，促進(jìn)了Rev-erbα的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄（圖5I-J）。總之，Lnc-UC通過(guò)減弱Cbx1介導(dǎo)的H3K9三甲基化來(lái)調(diào)控Rev-erb轉(zhuǎn)錄(圖5K)。具體地說(shuō)，Lnc-UC可能作為誘餌，吸引從Rev-erb啟動(dòng)子中去除Cbx1及其伙伴Suv39h1(圖5K)。因此，H3K9的三甲基化減弱，Rev-erb轉(zhuǎn)錄被激活(圖5K)。

圖5 Lnc-UC與Cbx1和調(diào)節(jié)Rev-erbα轉(zhuǎn)錄通過(guò)減少H3K9的三甲基

6、hLnc-UC是一種循環(huán)、抗炎的lncRNA

探究Lnc-UC在小鼠中的功能能否由于高度的物種保守而存在于人類(lèi)中，是很有意義的。因此，在人的樣本中檢測(cè)其是否存在，如圖6A，人Lnc-UC（hLnc-UC）被擴(kuò)增出來(lái)。并且hLnc-UC能在人結(jié)腸中檢測(cè)到，結(jié)腸炎患者表現(xiàn)出hLnc-UC，NLRP3，IL-1β表達(dá)升高（圖6B-C）。hLnc-UC在血清的THP-1細(xì)胞中有規(guī)律地表達(dá)，其模式類(lèi)似于BMAL1（圖6D）。 此外，hLnc-UC在THP-1細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Rev-erbα表達(dá)增加和Rev-erbα依賴(lài)性炎癥因子水平降低（圖6E-G）。在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果（圖6H-I）。 總之，這些數(shù)據(jù)表明，與結(jié)腸炎相關(guān)的hLnc-UC可能像在小鼠中一樣促進(jìn)Rev-erbα表達(dá)以抑制炎癥。

圖6 hLnc-UC是一種循環(huán)、抗炎的lncRNA

NF-κB驅(qū)動(dòng)的Lnc-UC充當(dāng)Rev-erbα的表觀遺傳調(diào)控因子，從而協(xié)調(diào)了晝夜節(jié)律和結(jié)腸炎。 Lnc-UC可能在干預(yù)炎癥和晝夜節(jié)律之間的交流并控制結(jié)腸炎。

參考文獻(xiàn)：

Wang Shuai., Lin Yanke., Li Feng., Qin Zifei., Zhou Ziyue., Gao Lu., Yang Zemin., Wang Zhigang., Wu Baojian.(2020). An NF-κB-driven lncRNA orchestrates colitis and circadian clock. Sci Adv, 6(42), undefined. doi:10.1126/sciadv.abb5202