機制研究套路-circNDUFB2抑制非小細胞肺癌進展

導語：環(huán)狀RNA（circRNA）是一類共價閉合的單鏈RNA，與癌癥進展有關。肺癌是最常診斷的癌癥之一，也是大多數(shù)國家癌癥死亡的主要原因。非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌病例的85%。CircRNA在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中誘導免疫反應的行為和機制尚未見報道。
參考文獻：circNDUFB2 inhibits non-small cell lung cancer progression via destabilizing IGF2BPs and activating anti-tumor immunity （IF=12.121）

技術路線：

結(jié)果：

1. NSCLC中circNDUFB2下調(diào)

微陣列芯片分析NSCLC樣本中circRNA表達譜，共鑒定出109個失調(diào)circRNA，其中33個上調(diào)，76個下調(diào)，qRT-PCR證實來源于NDUFB2的hsa_circ_0007518，命名為circNDUFB2，下調(diào)最顯著。circNDUFB2的高表達與NSCLC患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期呈負相關。引物擴增+Sanger測序確認circNDUFB2由NDUFB2基因外顯子2-3生成，RNase R核酸外切酶消化的抗性證實circNDUFB2含有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，放線菌素D處理顯示circNDUFB2穩(wěn)定，核質(zhì)分離以及熒光原位雜交(FISH)顯示circNDUFB2主要定位于細胞質(zhì)。

2. circNDUFB2抑制NSCLC進展

體外實驗證實circNDUFB2過表達顯著抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，circNDUFB2敲低促進這些表型。體內(nèi)實驗顯示circNDUFB2過表達可抑制NSCLC細胞的致瘤性和轉(zhuǎn)移。這些表明，circNDUFB2可能在NSCLC的進展中起抑制作用。

3. circNDUFB2與IGF2BPs相互作用，促進泛素/蛋白酶體介導的IGF2BPs降解

為檢測circNDUFB2是否作為miRNA海綿調(diào)節(jié)NSCLC的靶標，進行RIP檢測。FLAG抗體顯著富集ciRS-7（一種與AGO2結(jié)合的circRNA），但未富集circNDUFB2，表明circNDUFB2可能在NSCLC進展中不作為miRNA海綿發(fā)揮作用。RNA pull-down實驗探索circNDUFB2是否通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能，circNDUFB2的正義探針可高效、特異地富集circNDUFB2，質(zhì)譜分析前三個豐富的蛋白分別是IGF2BP2、IGF2BP1和IGF2BP3。免疫熒光發(fā)現(xiàn)circNDUFB2與IGF2BPs在細胞質(zhì)共定位。突變circNDUFB2結(jié)合區(qū)域顯著降低IGF2BPs和circNDUFB2之間的相互作用。MeRIP觀察到circNDUFB2中m6A顯著富集，敲除METTL3和METTL14可顯著降低circNDUFB2中m6A修飾水平，且不會改變circNDUFB2水平，METTL3/14敲除顯著損害了circNDUFB2和IGF2BPs之間的相互作用。circNDUFB2未顯著改變IGF2BPs的mRNA水平，但在circNDUFB2過表達中IGF2BPs的蛋白水平顯著降低，在circNDUFB2敲低中增加。circNDUFB2過表達顯著降低了IGF2BP蛋白的水平，這可被MG132（一種特異性蛋白酶體抑制劑）恢復。circNDUFB2顯著增加IGF2BPs的泛素化水平，但該作用因其突變而受損。這些結(jié)果證明circNDUFB2通過增強泛素/蛋白酶體依賴性降解降低IGF2BPs的穩(wěn)定性。

4. TRIM25是介導IGF2BPs泛素化的E3連接酶，circNDUFB2作為一個支架，增強IGF2BP蛋白與TRIM25的結(jié)合
為鑒定IGF2BPs泛素化的E3連接酶，對RNA下拉沉淀物進行質(zhì)譜分析。在156個潛在的相互作用蛋白中發(fā)現(xiàn)了兩個E3連接酶，TRIM25和HECTD3。circNDUFB2與TRIM25的結(jié)合，circNDUFB2與TRIM25共定位在細胞質(zhì)中。TRIM25與所有三種IGF2BPs結(jié)合，共定位在細胞質(zhì)中。IGF2BPs的mRNA水平不受TRIM25影響，但IGF2BPs的蛋白水平在TRIM25敲低中顯著增加，在TRIM25過表達中顯著降低。同時，在TRIM25過表達的A549細胞中，IGF2BPs的泛素化水平顯著增加。這些結(jié)果表明，TRIM25在NSCLC細胞中與IGF2BP蛋白相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑降解。

探索TRIM25對IGF2BPs的泛素連接酶活性是否依賴于circNDUFB2。circNDUFB2的缺失顯示TRIM25對IGF2BPs泛素化和降解的減弱作用。為進一步驗證circNDUFB2是否作為支架增強TRIM25與IGF2BPs的結(jié)合，進行Co-IP分析。在circNDUFB2而非circNDUFB2-MUT過表達的細胞中，TRIM25和IGF2BPs之間的關聯(lián)增強。RNase A處理嚴重破壞了相互作用。在METTL3/14敲除后，IGF2BPs的泛素化顯著減少。綜上所述，表明circNDUFB2作為支架增強TRIM25和IGF2BPs之間的相互作用，隨后促進TRIM25介導的IGF2BPs的泛素化和降解。

5. circNDUFB2觸發(fā)NSCLC細胞的免疫防御反應

RNA-seq顯示，circNDUFB2過表達影響934個基因的表達水平，GO和KEGG分析顯示circNDUFB2觸發(fā)免疫防御和I型干擾素(IFNs)信號，GSEA也顯示參與免疫應答的靶基因的信號通路。circNDUFB2敲低降低了NSCLC細胞中免疫基因的水平，說明過表達circNDUFB2，導致免疫基因上調(diào)。ELISA證實，circNDUFB2過表達可顯著增加細胞培養(yǎng)上清液中CXCL10、CXCL11、CCL5和IFNβ的水平，circNDUFB2敲低可降低細胞培養(yǎng)上清液中這些細胞因子的水平。這些結(jié)果證明circNDUFB2在NSCLC細胞中引發(fā)免疫反應。

6. RIG-I對于circNDUFB2誘導的免疫反應至關重要

維甲酸誘導基因-I(RIG-I)敲低可消除circNDUFB2過表達誘導的免疫應答，RIG-I被circNDUFB2上調(diào)。circNDUFB2與RIG-I結(jié)合，共定位在細胞質(zhì)中。circNDUFB2顯著上調(diào)RIG-I、IRF7、IFNβ和TNF的蛋白水平，不影響P65和IRF3的蛋白水平，circNDUFB2顯著增加p-P65、p-IRF3、p-STAT1和p-STAT2，促進IRF3和P65易位進入細胞核。RIG-I敲低顯著消除circNDUFB2誘導的基因的蛋白水平或磷酸化水平的上調(diào)以及IRF3和P65的核轉(zhuǎn)位。上述結(jié)果提示，RIG-I介導circNDUFB2引起的免疫應答。circNDUFB2抑制CARDs和RIG-I的解旋酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，增強CARDs與線粒體抗病毒信號蛋白的相互作用，表明circNDUFB2可通過破壞CARDs與其解旋酶結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用，并使RIG-I保持活性形式，隨后引發(fā)RIG-I-MAVS信號級聯(lián)的激活，從而激活RIG-I。

本文的機制圖：