樺樹皮的新潛能：白樺素改善高脂血癥和胰島素抵抗以及動(dòng)脈粥樣硬化

固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是激活高脂血癥特征性膽固醇、脂肪酸和甘油三酯生物合成的主要轉(zhuǎn)錄因子。本研究中發(fā)現(xiàn)了一種小分子，白樺素，它通過誘導(dǎo)SREBP裂解激活蛋白(SCAP) 與Insig相互作用特異性地抑制SREBP的成熟，進(jìn)而降低膽固醇和脂肪酸的生物合成，改善飲食誘導(dǎo)的肥胖，降低血清和組織中的脂質(zhì)含量，提高胰島素敏感性，減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小。樺樹皮中含有豐富的白樺素，有望成為開發(fā)治療高脂血癥藥物的先導(dǎo)化合物。本研究于2021年1月發(fā)表在《Cell Metabolism》IF:21.567期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、白樺素作為SREBP加工特異性抑制劑的鑒定

構(gòu)建了一個(gè)由含SRE啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因，并從人肝癌細(xì)胞系Huh-7中生成了穩(wěn)定表達(dá)該報(bào)告基因的細(xì)胞系(命名為Huh-7/SRE-Luc)。然后將該細(xì)胞與不同化合物孵育，并進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。有趣的是，只有白樺素[lup-20(29)-ene-3b, 28-diol]有效降低了熒光素酶的活性。白樺素是一種天然存在的五環(huán)三萜，可以很容易地從樺樹皮中提取出來(最高可達(dá)干重的30%)。

作者直接檢測(cè)了白樺素對(duì)SREBP加工的影響和特異性，并與25-HC進(jìn)行比較。25-HC有三個(gè)主要作用：通過抑制SREBP-2的切割降低n-SREBP-2(圖1A)；激活LXR，進(jìn)而上調(diào)SREBP-1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致n-SREBP-1的增加(圖1A)；促進(jìn)HMG-CoA還原酶(HMGCR)的降解，HMGCR是膽固醇生物合成中的限速酶(圖1B)。另一方面，白樺素有效降低了內(nèi)源性的n-SREBP-1和n-SREBP-2(圖1A)，表明白樺素在不激活LXR的情況下抑制了SREBP的加工。同時(shí)，白樺素并沒有促進(jìn)HMGCR的降解(圖1B)。同樣，白樺素以Insig依賴的方式完全阻止了轉(zhuǎn)染SREBP-2的裂解(圖1C)。因此，白樺素特異性地抑制了SREBP的加工，但并不激活LXR或加速HMGCR的降解。此外，在共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，白樺素刺激了SCAP和Insig-1之間的相互作用(圖1D, lanes 4和lanes 5)，這暗示白樺素的作用機(jī)制。   

圖1白樺素特異性抑制SREBP過程

為了進(jìn)一步測(cè)試白樺素是否通過與SCAP結(jié)合發(fā)揮作用，合成了一種白樺素衍生探針，命名為化合物1(圖2A)。化合物1包含一個(gè)光敏反應(yīng)基和一個(gè)疊氮乙?；?，可以通過點(diǎn)擊化學(xué)與生物素炔烴連接。與白樺素類似，化合物1可以抑制SREBP-2的加工(圖2B)?；衔?/span>1與膽固醇敲除的CHO細(xì)胞的膜組分孵育，然后暴露在紫外線下激活交聯(lián)。紫外線照射后，用click化學(xué)方法粘貼生物素標(biāo)簽。然后將膜球均質(zhì)化，與親和素結(jié)合的瓊脂糖孵育，以拉下白樺素結(jié)合蛋白。如圖2C所示，在化合物1和3 mM處，SCAP被沉淀，高濃度的白樺素可以取代其結(jié)合，說明白樺素與SCAP發(fā)生物理作用。作為陰性對(duì)照，用化合物1幾乎不沉淀轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，白樺素競爭沒有影響(圖2C)。總之，這些結(jié)果表明SCAP可能與白樺素結(jié)合，并且是其靶標(biāo)。   

圖2白樺素作為SREBP加工特異性抑制劑的鑒定

2、白樺素下調(diào)SREBP靶基因，降低細(xì)胞脂質(zhì)水平

由于SREBP-2是其自身的直接靶標(biāo)，因此白樺素將其表達(dá)下調(diào)40％（圖3A）。 與SREBP-2是膽固醇生物合成的主要轉(zhuǎn)錄因子這一觀點(diǎn)一致，膽固醇合成途徑中的10個(gè)被測(cè)基因，例如HMGCR，HMG-CoA合酶（HMGCS）和角鯊烯環(huán)氧酶（SE），都被白樺素處理抑制了（圖3A）。 類似地，與脂肪酸和甘油三酸酯合成有關(guān)的所有9個(gè)基因，例如SREBP-1c，脂肪酸合酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶α（ACC），都被白樺素顯著下調(diào)（圖3B）。 與早期觀察結(jié)果一致（圖1A），包括ABCG5和ABCG8在內(nèi)的LXR靶基因不受白樺素的影響（圖3C）。

與基因表達(dá)改變一致，白樺素處理以濃度依賴性的方式顯著減少了膽固醇和脂肪酸的從頭合成（圖3D-E）。此外，白樺素降低了細(xì)胞膽固醇（圖3F）和中性脂質(zhì)（主要是膽固醇酯和甘油三酸酯）的穩(wěn)態(tài)水平（圖3G）。 兩者合計(jì)，我們的數(shù)據(jù)表明白樺素抑制SREBP加工并下調(diào)膽固醇和脂肪酸的生物合成，從而降低細(xì)胞脂質(zhì)水平。 有趣的是，洛伐他汀顯著降低了膽固醇的合成（圖3D），但也適度地增加了脂肪酸的生物合成（圖3E），這可能是因?yàn)槁宸ニ∈?/span>HMGCR的抑制劑，它可以阻斷膽固醇的合成，進(jìn)而刺激SREBP的活化，從而增加脂肪酸合成。  

圖3白樺素抑制膽固醇和脂肪酸的生物合成通過降低SREBP的靶基因

3、白樺素可以改善小鼠飲食導(dǎo)致的肥胖并增加能量消耗

接下來，研究了白樺素在體內(nèi)的作用。洛伐他汀是一種HMGCR抑制劑，具有良好的有益作用，將其與白樺素進(jìn)行比較。用對(duì)照（鹽水），洛伐他?。?/span>30 mg/kg/day）或白樺素（15或30 mg/kg/day）處理西式飲食（WD）的C57BL / 6J小鼠6周。在治療期間，未觀察到白樺素或洛伐他汀的明顯毒性，并且不同組的小鼠顯示出相似的食物攝入（圖4A）。有趣的是，盡管小鼠以30 mg/kg/day加WD飲食喂養(yǎng)的老鼠比chow飲食喂養(yǎng)的小鼠重，但它們的體重增加比WD喂養(yǎng)的老鼠少，這表明在此劑量下，白樺素和洛伐他汀可以預(yù)防飲食引起的肥胖癥（DIO）（圖4B）。洛伐他汀對(duì)體重的影響與以前的報(bào)道一致。

為了了解白樺素和他汀類藥物的抗DIO作用，進(jìn)一步分析了脂質(zhì)吸收，體力活動(dòng)和能量消耗。在洛伐他汀治療的小鼠中，盡管呼吸商（RQ）增強(qiáng)，表明從體內(nèi)利用葡萄糖和蛋白質(zhì)進(jìn)行能量生產(chǎn)已超過脂質(zhì)氧化，但耗氧量和總能量消耗仍與WD喂養(yǎng)的小鼠相似（圖4F-4H）。另一方面，用洛伐他汀喂養(yǎng)的小鼠的糞便膽固醇和甘油三酸酯（TG）顯著增加（圖4C和4D），表明洛伐他汀降低脂質(zhì)吸收或增加脂質(zhì)排泄，從而拮抗DIO。這一觀察結(jié)果與以前的報(bào)告是一致的。另一方面，白樺素對(duì)脂質(zhì)吸收/排泄沒有影響（圖4C和4D）。盡管每組小鼠的身體活動(dòng)都相似（圖4E），但接受白樺素的小鼠的RQ升高（圖4F），其耗氧量和能量消耗也增加了（圖4G和4H），這可能有助于他們體重增加量的減少。同時(shí)，接受30 mg / kg /day白樺素的小鼠暴露于寒冷時(shí)顯示出更高的體溫（圖4I）。進(jìn)一步的Q-PCR分析顯示，在經(jīng)白樺素處理的小鼠中，棕色脂肪細(xì)胞組織（BAT）中的兩個(gè)關(guān)鍵生熱基因UCP-1和UCP-2升高（圖4J）。該觀察結(jié)果與關(guān)于UCP-1在n-SREBP-1c轉(zhuǎn)基因小鼠的BAT中顯著降低的報(bào)道是一致的?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，洛伐他汀可能通過減少脂質(zhì)吸收/增加排泄來至少部分地預(yù)防DIO，而白樺素通過增加能量消耗來改善DIO。

圖4白樺素對(duì)小鼠體重，糞便脂質(zhì)和能量消耗的影響

4、白樺素能改善小鼠血液、肝臟和脂肪組織中的脂質(zhì)參數(shù)

測(cè)量了血液和其他組織中的脂質(zhì)水平，如圖5所示。洛伐他汀和白樺素處理的小鼠的血清總膽固醇（TC）和甘油三酸酯（TG）的水平顯著低于對(duì)照治療的小鼠（圖5A和5B）。值得注意的是，與洛伐他汀相似，白樺素降低了LDL膽固醇（LDL-c）的含量并增加了HDL膽固醇（HDL-c）（圖5C和5D）。 有趣的是，盡管白樺素和洛伐他汀均降低了肝臟的TC水平，但只有白樺素顯著降低了肝臟的TG含量（圖5E和5F）。

組織學(xué)分析表明，白樺素可以減少白色脂肪細(xì)胞組織（WAT）和棕色脂肪細(xì)胞組織（BAT）的細(xì)胞大小，而洛伐他汀僅可以減少棕色脂肪細(xì)胞的大?。▓D5G）。 油紅色O切片染色表明，與用WD喂養(yǎng)的對(duì)照治療小鼠的肝臟相比，洛伐他汀或白樺素處理的小鼠的肝臟具有較低的脂質(zhì)蓄積（圖5G）。這與洛伐他汀和白樺素降低肝脂質(zhì)含量的先前數(shù)據(jù)一致（圖5E和5F）。

圖5 白樺素對(duì)血液和組織中的脂質(zhì)水平的影響

5、白樺素可以改善小鼠的胰島素抵抗

由于白樺素可降低血清和組織中的脂質(zhì)水平，因此接下來研究了白樺素是否可改善體內(nèi)胰島素抵抗。與進(jìn)食chow糧的小鼠相比，由WD喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)出葡萄糖受損和胰島素耐受性。WD喂養(yǎng)的小鼠的白樺素或洛伐他汀治療可顯著改善葡萄糖耐量和胰島素抵抗（圖6A-6D）。 此外，WD喂養(yǎng)的小鼠的空腹血糖和胰島素升高通過白樺素的施用而被顯著降低，但洛伐他汀卻沒有（圖6E和6F）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，白樺素可改善小鼠的胰島素抵抗。  

圖6 白樺素對(duì)飲食誘導(dǎo)的小鼠葡萄糖不耐受和胰島素抵抗的影響

6、白樺素降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展

用LDLR敲除小鼠探索了白樺素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的作用。LDLR缺陷小鼠用WD飲食并分別添加了成分，對(duì)照（鹽），洛伐他?。?/span>30 mg/kg/day）或白樺素（30 mg/kg/day）處理14周。不同組的小鼠顯示出相似的食物攝入量和體重（圖7A-7B）。在經(jīng)白樺素處理的小鼠肝臟中，SREBP-1c和SREBP-2降低，脂質(zhì)合成基因（包括HMGCS，HMGCR和FAS）下調(diào)（圖7C）。但是，洛伐他汀可上調(diào)HMGCR和FAS基因的表達(dá)（圖7C）。白樺素極顯著降低了血液中的TC，TG和LDL-c的含量，并增加了HDL-c（圖7D-7G）。洛伐他汀具有類似的作用，只是它不降低TG（圖7D–7G）。與對(duì)照處理的小鼠相比，洛伐他汀或白樺素處理的小鼠的主動(dòng)脈斑塊的數(shù)量和大小顯著降低（圖7H和7I）。特別是，主動(dòng)脈弓（圖7J）和胸主動(dòng)脈（圖7K）的病變區(qū)域明顯較小。以上數(shù)據(jù)表明，白樺素降低了WD喂養(yǎng)的LDLR敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成，并穩(wěn)定了主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊。

圖7 胰島素處理減輕LDLR^-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化

總之，本文確定了SREBP的一種特定的小分子抑制劑，即betulin白樺素，可以降低脂質(zhì)水平，增強(qiáng)胰島素敏感性并減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。 這些數(shù)據(jù)支持以下觀點(diǎn)：抑制SREBP途徑可能是治療II型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的有用策略。 Betulin可以作為藥物控制代謝性疾病的主要化合物。

參考文獻(xiàn)：

Tang JJ, Li JG, Qi W, et al, 2021. Inhibition of SREBP by a Small Molecule, Betulin,

Improves Hyperlipidemia and Insulin Resistance and Reduces Atherosclerotic Plaques. Cell Metabolism. 13:44-56. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.12.004