外泌體介導的CD44v6/C1QBP復合物與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移

胰管腺癌(PDAC)有明顯的肝轉(zhuǎn)移傾向。促癌分泌體通過外泌體傳遞和運輸是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成和轉(zhuǎn)移的關鍵。2021年4月發(fā)表于Gut（IF=19.819）的文章“Exosome-delivered CD44v6/C1QBP complex drives pancreatic cancer liver metastasis by promoting fibrotic liver microenvironment”對此進行了探究。本研究旨在探討PDAC來源的外泌體(Pex)調(diào)控肝臟微環(huán)境、促進轉(zhuǎn)移的潛在機制。Pex衍生的CD44v6/C1QBP復合物對于肝纖維化微環(huán)境和PDAC肝轉(zhuǎn)移的形成是必不可少的。高表達的外泌體CD44v6和C1QBP是預測PDAC患者預后和肝轉(zhuǎn)移的很有前途的生物標志物。

技術路線

結果

1）Pex誘導肝纖維化微環(huán)境，促進PDAC肝轉(zhuǎn)移
   從小鼠正常胰腺(Npex)和小鼠PDAC細胞分離的外泌體呈現(xiàn)典型的外泌體結構，大小約為50-150 nm(圖1A，B)。進一步的western blot分析證實了分離的外泌體的存在(圖1C)。為了確定Pex在PDAC肝轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先進行了“教育”程序，并進一步通過脾內(nèi)注射建立了PDAC肝轉(zhuǎn)移模型(圖1D)。在“教育”過程后，STE和原子力顯微鏡(AFM)顯示，與Npex組相比，Pex組小鼠的肝臟剛度顯著增加(圖1E，F(xiàn))。此外，肝組織膠原密度增加(圖1G)，肝ECM明顯重構(圖1H，I)。同樣，PDAC原位植入模型也顯示原位腫瘤可增加肝臟膠原沉積。肝轉(zhuǎn)移模型顯示，與Npex組相比，Pex組肝轉(zhuǎn)移更多，肝質(zhì)量更高(圖1J)。這些數(shù)據(jù)表明，Pex可以通過重構肝臟ECM來誘導肝纖維化微環(huán)境，促進PDAC肝轉(zhuǎn)移。

2）Pex增強肝衛(wèi)星細胞(HSCs)的活性
   為了證實Pex的生物學功能，將原代小鼠肝細胞與Pex孵育，Pex被受體細胞吸收。然后使用免疫熒光染色對原發(fā)性肝細胞的類型進行表征，結果顯示，desmin+HSCs和F4/80+Kupffer細胞吸收了Pex(圖2A)。我們接下來研究了Pex對HSCs生物學行為的影響，發(fā)現(xiàn)Pex顯著增強了HSCs的增殖和遷移能力(圖2B和C)。Pex與Npex處理的HSCs的凋亡沒有顯著差異(圖2D)。western blot和免疫熒光檢測結果顯示，Pex顯著上調(diào)α-SMA的表達，說明Pex能促進HSC的活化(圖2E和F)。我們觀察到Pex可以通過下調(diào)vitronectin和tenascin C的表達，上調(diào)collagen I和fibronectin的表達來調(diào)節(jié)HSCs中的ECM分泌(圖2G)。

3） IGF-1信號在Pex誘導的HSC活化和肝纖維化中至關重要
   為了進一步探索Pex調(diào)控HSC行為的機制，我們比較了Pex和Npex組間的HSC的RNA測序基因表達譜(圖3A)。在差異表達基因中，我們觀察到41個重疊的上調(diào)基因在Pan02 exo組與Npex組和KPC exo組與Npex組之間存在部分交集(圖3B)。主要涉及的基因參與細胞外空間、細胞外區(qū)域和ECM(圖3C)，表明Pex調(diào)節(jié)HSC的ECM分泌。此外，GO和KEGG通路分析顯示，IGF-1及其下游PI3K/AKT是受Pex影響的排名最高的信號通路(圖3D，E)。western blot分析支持了Pex顯著增加HSC中IGF- 1R、IRS-1和AKT磷酸化的發(fā)現(xiàn)(圖3F)。當使用IGF-1R抑制劑時，Pex誘導的p-IGF-1R、p-IRS-1和p- AKT的上調(diào)被阻斷(圖3G)?；谶@些結果，我們推測IGF-1信號可能是介導Pex依賴的HSC活化的關鍵因素。與預期的一樣，IGF-1R抑制劑抑制了Pex誘導的HSC的活化、增殖和遷移(圖4A-D)。此外，IGF-1R抑制劑逆轉(zhuǎn)了Pex誘導的HSC中ECM的產(chǎn)生(圖4E)。我們的體內(nèi)實驗表明，IGF-1R抑制劑可以阻斷Pex誘導的肝纖維化(圖4F-I)。這些數(shù)據(jù)表明IGF-1信號在Pex誘導的肝纖維化中起重要作用。

4）Pex來源的CD44v6對于HSCs的激活是必要的，但不是充分的
   我們之前的研究揭示了CD44v6參與調(diào)控PDAC細胞的IGF-1通路。因此，我們首先驗證了CD44v6在外泌體中的表達，發(fā)現(xiàn)CD44v6在Pex中的表達水平明顯高于Npex(圖5A)。為了研究CD44v6是否能夠被傳遞到受體細胞中，我們采用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺檢測加入Pex后CD44v6的蛋白水平。western blot分析顯示，加入Pex后，HSCs中CD44v6的表達水平明顯增加(圖5B)。與Npex-孵育的細胞相比，CD44v6的表達水平保持不變(圖5B)。我們還進行了免疫熒光分析，檢測出HSC膜中CD44v6與Pan-cadherin共定位(圖5C)。這些結果表明，Pex可將CD44v6輸送到HSC膜。此外，western blot檢測表明，敲除CD44v6或使用抗CD44v6抗體的Pex強烈減弱了Pex誘導的IGF-1信號通路的激活(圖5D)。同時，在CD44v6- kd Pex或CD44v6抗體的作用下，Pex誘導的HSC活化(圖5E，F(xiàn))、ECM重塑(圖5G)的積極作用顯著減少。為了闡明CD44v6在Pex誘導的HSC激活中的作用，我們進一步研究了過表達CD44v6在HSC中是否與Pex具有同樣的激活HSC的作用。然而，過表達CD44v6并沒有像預期的那樣提高α-SMA的表達(圖5H)。這些結果表明，CD44v6在Pex誘導的HSC激活中發(fā)揮了重要作用。

5）Pex衍生的CD44v6/C1QBP復合物介導了Pex對肝纖維化和PDAC肝轉(zhuǎn)移的積極作用
   此前，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1可以通過誘導補體C1q結合蛋白(C1QBP)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到膜上，驅(qū)動CD44v6/C1QBP復合物的形成，從而激活IGF-1下游通路。因此，我們很想知道C1QBP是否通過CD44v6相互作用參與Pex誘導的HSC活化。我們的結果表明C1QBP在Pex中的表達明顯高于Npex(圖6A)。如圖6B所示，C1QBP在Pex孵育的HSCs中表達高于Npex組。同時，與Pex處理的細胞相比，C1QBP-kd Pex處理HSCs后C1QBP蛋白水平顯著降低(圖6B)。與Pex轉(zhuǎn)移的CD44v6在HSCs中的位置一致，膜中也檢測到C1QBP，并與Pan-cadherin共定位(圖6C)。這些數(shù)據(jù)表明，C1QBP可以通過Pex傳遞到HSCs膜。免疫電鏡顯示CD44v6和C1QBP在Pex中共表達(圖6D)。同時過表達CD44v6和C1QBP后，Co- IP檢測顯示CD44v6和C1QBP在Pex中相互作用(圖6E)。此外，通過近距離連接(圖6F)和免疫熒光分析(圖6G)，我們發(fā)現(xiàn)了CD44v6和C1QBP在Pex孵化的HSCs膜上的結合。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD44v6在傳遞外泌體CD44v6/C1QBP復合物中起重要作用。
   與CD44v6敲低實驗的結果相似，敲低Pex中的C1QBP在很大程度上抑制了α-SMA表達(圖6H)。過表達C1QBP并沒有上調(diào)α-SMA的表達(圖6I)。同時過表達CD44v6和C1QBP顯著增加了α-SMA的表達(圖6I)。與我們的體外研究一致，敲除Pex中的CD44v6或C1QBP逆轉(zhuǎn)了Pex誘導的HSC激活、肝臟剛度增加和肝臟ECM重塑的作用(圖6J-L)。脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型(圖6M)顯示，與Pex組相比，注射了CD44v6- kd或C1QBP- kd的Pex組小鼠的肝轉(zhuǎn)移減少。這些結果表明，Pex衍生的CD44v6/C1QBP復合物介導了Pex對肝纖維化和PDAC肝轉(zhuǎn)移的積極作用。

6）Pex衍生的CD44v6和C1QBP的高表達預示著PDAC患者的肝轉(zhuǎn)移和低生存率
   采用免疫組化和western blot檢測肝轉(zhuǎn)移灶周圍肝組織和正常肝組織的纖維化ECM微環(huán)境。與體內(nèi)實驗一致，纖維連接蛋白、I型膠原和α-SMA水平顯著升高，而玻連蛋白和固生蛋白C水平下調(diào)(圖7A，B)。接下來，我們研究了外泌體衍生CD44v6和C1QBP在PDAC患者中的預后價值。外泌體CD44v6和C1QBP在PDAC組織中的表達明顯高于正常胰腺組織(圖7C)。此外，有肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者外泌體CD44v6和C1QBP的表達明顯高于無肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者(圖7C)。免疫電鏡顯示，CD44v6和C1QBP在PDAC組織來源的EVs中共表達(圖7D)。Pex中CD44v6和C1QBP高表達的患者比其他患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移 (圖7E)。此外，生存分析顯示，EV中CD44v6和C1QBP高表達的患者的生存結局明顯較差(圖7F)。循環(huán)外泌體的隨訪數(shù)據(jù)也顯示了一致的結果。PDAC患者中循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的表達明顯高于健康對照組(圖7G)， PDAC伴有肝轉(zhuǎn)移的患者中循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的表達明顯高于無肝轉(zhuǎn)移的患者(圖7G)。免疫電子顯微鏡顯示，CD44v6和C1QBP在PDAC患者的循環(huán)外泌體中共表達(圖7H)。高循環(huán)外泌體表達CD44v6和C1QBP的患者比其他患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移 (圖7I)。然而，高表達循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的患者生存率明顯較差(圖7J)?？傊?，我們的研究結果證實了CD44v6和C1QBP在組織源性EV和循環(huán)外泌體中的表達可以預測PDAC患者的預后和肝轉(zhuǎn)移。

結論：我們揭示了原代PDAC細胞和HSCs之間通過PDAC來源的外泌體進行遠距離的細胞通信。此外，Pex通過促進肝纖維化微環(huán)境的形成來指示肝特異性轉(zhuǎn)移。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)外泌體CD44v6/C1QBP復合物傳遞到HSC的質(zhì)膜上誘導IGF-1信號通路的激活。外泌體CD44v6和C1QBP可能是預測PDAC患者預后的有前途的生物標志物，也是治療PDAC肝轉(zhuǎn)移的潛在靶點。