外傷性損傷損害核漿運輸，導(dǎo)致TDP-43病理

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是世界范圍內(nèi)最常見的死亡和殘疾原因之一。事實上，創(chuàng)傷性腦損傷導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷可導(dǎo)致長期的神經(jīng)和神經(jīng)精神后遺癥，包括神經(jīng)退行性疾病，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、阿爾茨海默病(AD)和帕金森病。TBI還與慢性創(chuàng)傷性腦病(CTE)的發(fā)展有關(guān)，CTE是一種與反復(fù)頭部創(chuàng)傷相關(guān)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性綜合征。反復(fù)創(chuàng)傷患者(如CTE)的死后腦組織以及創(chuàng)傷性腦損傷動物模型顯示微管相關(guān)蛋白(TAU)和TAR DNA/RNA結(jié)合蛋白(TDP-43)病理變化。TDP-43病理是神經(jīng)退行性變的標(biāo)志，在~ 97%的ALS病例、~ 45%的額顳葉癡呆(FTD)病例和~ 60%的AD病例中均有TDP-43表現(xiàn)。盡管有證據(jù)表明TDP-43病理作為神經(jīng)退行性變的生物標(biāo)志物，但仍不清楚重復(fù)創(chuàng)傷如何促進(jìn)TDP-43蛋白病。

TDP-43是一種主要的核DNA/RNA結(jié)合蛋白，穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間。TDP-43調(diào)控RNA處理，如基因轉(zhuǎn)錄、mRNA剪接、mRNA穩(wěn)定性、mRNA運輸和定位，病理突變破壞RNA代謝。在許多神經(jīng)退行性疾病中，TDP-43偏離細(xì)胞核并聚集在細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)TDP-43聚集體被認(rèn)為是神經(jīng)退行性變的重要機制，因為這些聚集體被異常磷酸化和泛素化。有多種機制被提出來解釋神經(jīng)退行性疾病中TDP-43異常的細(xì)胞質(zhì)積累和TDP-43病理的進(jìn)行性擴散。

TDP-43包含一個類似朊病毒的低復(fù)雜度域，并具有一個本質(zhì)上的無序區(qū)域(IDR)，使TDP-43易于聚集。RNA結(jié)合蛋白(rbp)中的IDRs被認(rèn)為在核糖體蛋白顆粒(如p -小體、應(yīng)激顆粒和神經(jīng)元顆粒)的組裝中起關(guān)鍵作用，提示rbp的突變或異常聚集可能會破壞這些顆粒的動力學(xué)。此外，rbp中的IDRs如TDP-43經(jīng)歷了液-液相分離，TDP-43的病理突變改變了液-液相分離，這可能有助于疾病進(jìn)程。因此，rbp如TDP-43的改變可能是神經(jīng)退行性變的重要指標(biāo)。然而，盡管這些機制可能解釋了TDP-43病理突變在神經(jīng)退行性疾病中的作用，但TDP-43如何在無突變的情況下聚集形成并導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病，如反復(fù)創(chuàng)傷患者的大腦，目前尚不清楚。

最近有報道稱，ALS/FTD中TDP-43的聚集可以隔離核孔蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白和其他因子，表明TDP-43的聚集強烈破壞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(NCT)和核孔復(fù)合體。此外，在AD、ALS和亨廷頓氏病(HD)中NCT也被破壞，提示在這些神經(jīng)退行性疾病中有一個共同的功能失調(diào)途徑。然而，TDP-43在反復(fù)顱腦損傷致神經(jīng)退行性變中的病理機制尚不清楚。此報道之前曾證明，重復(fù)的創(chuàng)傷導(dǎo)致果蠅大腦中的泛素、p62和TDP-43包涵體以及應(yīng)激顆粒病理。在這里，我們對果蠅的大腦進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以確定創(chuàng)傷損傷后改變的分子通路。

2021年5月，在Elife 雜志上發(fā)表了文章“Traumatic injury compromises nucleocytoplasmic transport and leads to TDP-43 pathology.”。此報道在體內(nèi)，反復(fù)的創(chuàng)傷會上調(diào)核孔蛋白，改變核孔蛋白的穩(wěn)定性，改變NCT蛋白，改變RanGAP1和核孔蛋白的分布，改變NCT。此外，核輸出的藥理抑制可以防止tbi介導(dǎo)的致命性和NCT缺陷。有趣的是，在體內(nèi)和體外，核孔蛋白的上調(diào)導(dǎo)致TDP-43定位錯誤、聚集、磷酸化和溶解性改變，并降低運動功能和壽命。對NUP62病理和CTE患者腦組織中NUP62濃度升高的研究結(jié)果表明NCT缺陷與創(chuàng)傷損傷有關(guān)，這可能介導(dǎo)了TDP-43的病理變化。 
  技術(shù)路線

一、腦損傷改變了果蠅的大腦蛋白質(zhì)組，擾亂了NCT蛋白和Nup蛋白水平

為了研究創(chuàng)傷性腦損傷的機制，我們使用了一個具有良好特征的創(chuàng)傷性腦損傷果蠅模型，該模型顯示了強大的表型，如TDP-43同源物(Tbph)、p62、應(yīng)激顆粒和泛素病理，以識別和研究創(chuàng)傷性腦損傷后大腦蛋白質(zhì)組的變化(圖1A)。對暴露于重復(fù)TBI的三齡果蠅幼蟲大腦中的2000個蛋白質(zhì)進(jìn)行了無偏性蛋白質(zhì)組學(xué)分析(w1118)，發(fā)現(xiàn)361個蛋白質(zhì)在創(chuàng)傷損傷后發(fā)生了顯著變化(p 0.05，學(xué)生t檢驗)?；诨虮倔w論(GO)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析在BiNGO (Cytoscape 3)中對tbi相關(guān)腦蛋白質(zhì)組與非tbi對照進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，確定了不同類別的改變蛋白，其中大多數(shù)上調(diào)(圖1B和C;圖1圖補充1A-E;補充文件1和3)。TBI后上調(diào)的最高類別是微管細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)折疊和蛋白酶體。此外，我們還鑒定了涉及核蛋白復(fù)合體和剪接體的蛋白質(zhì)。核孔復(fù)合體(NPC)和NCT通路的組成部分是tbi后上調(diào)的主要蛋白子集(圖1圖補充1F)。鼻咽癌通路此前尚未被認(rèn)為與創(chuàng)傷介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變有關(guān)，但據(jù)報道，在ALS/FTD、AD、HD和其他神經(jīng)退行性疾病中，鼻咽癌通路被破壞。因此，我們決定進(jìn)一步研究鼻咽癌改變介導(dǎo)TDP-43在TBI中的病理變化。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，一些Nups在腦損傷時被上調(diào)(圖1D和E)。對這些Nups的定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析證實，TBI顯著上調(diào)Nup93-2、Nup54、Nup62、Nup44A，和Nup214 mRNA水平的果蠅幼蟲(圖1F I和圖1圖Supplement 1G)和成年大腦(圖1J L)。此外，核輸出基因Emb (Exportin)的mRNA水平在tbi后顯著增加(圖1M)，而與對照組相比，微管相關(guān)蛋白Futsch的mRNA水平?jīng)]有變化(圖1圖Supplement 1H)，這與蛋白質(zhì)組學(xué)分析一致。Western blotting進(jìn)一步證實了tbi依賴性的果蠅幼蟲腦內(nèi)Nup214蛋白水平的升高(圖1N和O)。Western blot分析了損傷后幼蟲(0、2、4和6小時)和成蟲(0、2、4、24和72小時)的時間過程，以評估Nup214蛋白的水平。在檢測的時間點上，不管是幼蟲還是成人的大腦中，Nup214蛋白的水平都是上調(diào)的(圖1P,Q,R,S)，這表明創(chuàng)傷可能會破壞Nup214的水平和體內(nèi)的轉(zhuǎn)換。

二、TBI破壞了NPC和RanGAP1的分布，導(dǎo)致TBPH/NPC共聚集

使用鼻咽癌標(biāo)記Mab414，它可以識別包括Nup62在內(nèi)的幾個Nups的FG結(jié)構(gòu)域，我們發(fā)現(xiàn)在非tbi控制的果蠅大腦中，核膜上有一個主要的同質(zhì)的環(huán)狀標(biāo)記。非腦外傷對照組的腹神經(jīng)索(VNC)鼻咽癌染色呈均勻分布。相比之下，暴露于TBI的vnc核膜NPC染色不規(guī)則，顯示核形態(tài)紊亂。我們在腦外傷后觀察到核膜間隙和聚集(Mab414團(tuán)塊)的出現(xiàn)(圖2A)。TBI腦中Mab414染色異常的細(xì)胞百分比明顯高于非TBI對照(圖2B）。tbi暴露的vnc中Tbph和Mab414的核周和細(xì)胞質(zhì)共聚集，而對照大腦顯示很少或沒有共聚集(圖2C)。定量結(jié)果顯示，與對照組相比，tbi暴露的vnc中具有共聚集的Mab414 tbph陽性細(xì)胞百分比顯著升高(圖2D)。RanGAP1對Ran-GTP的水解對于核出口過程中貨物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)至關(guān)重要。RanGAP1維持核/細(xì)胞質(zhì)Ran梯度，其丟失會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在非tbi對照組大腦中，RanGAP1在核膜內(nèi)分布均勻，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出強烈的核信號。但tbi暴露后，RanGAP1染色分布異常，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)強度高(圖2E）。與對照組相比，腦外傷后RanGAP1分布異常的細(xì)胞百分比明顯增高(圖2F）。反復(fù)的創(chuàng)傷損傷會干擾RanGAP1在大腦中的定位。TBI大鼠損傷皮質(zhì)(同側(cè)半球)下海馬區(qū)域的腦細(xì)胞表現(xiàn)出錯誤定位和/或聚集(箭頭)或強烈的RanGAP1核染色(箭頭)，而假手術(shù)對照組主要是光滑的核周染色(圖2H)。與假對照相比，創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的NUP62顯示了明顯的胞質(zhì)(箭頭)和核(箭頭)錯位，假對照顯示了很少的胞質(zhì)(而沒有核)錯位(圖2J)。創(chuàng)傷性腦損傷腦組織中NUP62病理細(xì)胞的百分比明顯高于假手術(shù)對照組(圖2K).

三、在體內(nèi)，tbi介導(dǎo)的NCT缺陷和致死率被核輸出抑制劑抑制

為了確定TBI是否會損害體內(nèi)的核質(zhì)運輸，我們在果蠅運動神經(jīng)元中過表達(dá)了一個帶有核定位序列(NLS)和核輸出序列(NES)標(biāo)記的GFP蛋白(OK371-gal4)。在表達(dá)nlsnes -GFP的大腦中，GFP信號分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖3A)。然而，定量分析顯示，在nls - nes -GFP表達(dá)的vnc暴露于TBI中，核GFP信號減少的細(xì)胞百分比顯著增加，而核GFP強度顯著降低(圖3B和C)，說明GFP核進(jìn)口受到抑制和/或GFP核出口增加。接下來，我們在運動神經(jīng)元中表達(dá)了一種用NLS和突變的NES (ΔNES)標(biāo)記的沒有核輸出活性的GFP蛋白。表達(dá)NLS的非創(chuàng)傷性腦損傷動物的腦細(xì)胞-ΔNES-GFP顯示了GFP在細(xì)胞核的強大定位(圖3A)，而創(chuàng)傷性腦損傷動物的vnc顯示了核GFP減少的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，核GFP強度降低((圖3B和C)。果蠅幼蟲暴露于TBI，并在DMSO單獨、KPT-350(0.05、0.1或0.5 mM)或KPT-276(50、200或1000 nM)上飼養(yǎng)。對經(jīng)歷過TBI的果蠅幼蟲的羽化試驗顯示，KPT-350處理的動物(圖3D)或KPT-276處理的動物(圖3E)具有顯著的劑量依賴性的致死抑制。kpt -350處理的果蠅核GFP信號顯著高于dmso處理的對照組(圖3G）。

四、在體內(nèi)和體外，NUPs的上調(diào)導(dǎo)致TDP-43/TBPH定位錯誤和聚集

為了檢測Nup上調(diào)對Tbph (Drosophila TDP-43)病理的影響，我們建立了一個位點特異性Nup62過表達(dá)(Nup62 OE)蠅線，并對內(nèi)源性Tbph進(jìn)行染色。在eGFP對照(以下稱為對照)表達(dá)的果蠅幼蟲VNC中，Tbph的分布以細(xì)胞核為主，而Nup62 OE幼蟲VNC顯著改變了Tbph的定位，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)聚集(圖4A)。定量分析顯示，與對照組相比，Nup62 OE果蠅幼蟲或成年大腦中斑點Tbph顯著增加(圖4B）。與對照組相比，Nup62 OE vnc的核Tbph強度顯著降低(圖4C)。此外，核細(xì)胞質(zhì)(N/C)分割進(jìn)一步證實，與對照組相比，Nup62 OE動物的Tbph N/C比值顯著降低(圖4D和E)，表明Nup62的上調(diào)改變了Tbph在體內(nèi)的亞細(xì)胞定位。Nup62表達(dá)引起的Tbph的錯位和聚集也讓我們檢測了Nup62表達(dá)是否影響Tbph的溶解度。Nup62 OE或?qū)φ展壌竽X的可溶性-不可溶性分選顯示，與對照相比，Nup62在運動神經(jīng)元中表達(dá)的上調(diào)顯著增加了不溶性，從而改變了Tbph的可溶性(圖4F和G)，表明Nup62水平是Tbph溶解度的重要決定因素。qPCR證實了Nup62的過表達(dá)(圖4H)。NUP62與內(nèi)源性TDP-43共聚合(圖4I)。與單獨mRuby相比，NUP62在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致TDP-43的溶解性顯著改變(圖4J和K）。檢測了nup62介導(dǎo)的TDP-43聚集物在HEK293T細(xì)胞中是否被磷酸化。內(nèi)源性與NUP62-mRuby共定位的TDP-43聚集體被磷酸化(圖4L)。 

五、敲除核孔蛋白來挽救核孔蛋白的表達(dá)導(dǎo)致果蠅的運動功能障礙和壽命縮短

Nup62、Nup214、Nup43在運動神經(jīng)元中過表達(dá)顯著降低了運動功能和攀爬速度(圖5A和B)。與各自的Nup對照或?qū)φ战M動物相比，過表達(dá)Nup62和Nup214或Nup62和Nup43的動物的壽命明顯縮短——Nup62/ Nup214 OE和Nup62/Nup43 OE的中位存活時間分別為23天和21天(圖5C)。用RNAi成蟲(Nup62或Nup214)多次暴露于創(chuàng)傷后，檢測其運動功能和壽命。Nup62 mRNA (p <0.01)和Nup214 mRNA (p <0.001)與對照組相比，Nup62和Nup214 RNAi處理組的攀爬水平顯著降低(圖5D和E)。有趣的是，Nup62 RNAi和Nup214 RNAi處理組創(chuàng)傷后攀爬水平顯著提高(圖5E, )和速度(圖5F）。

六、核孔病理存在于重復(fù)性TBI患者腦組織中，并與TDP-43病理共同聚集

輕度和重度CTE的組織，但年齡不匹配的對照組顯示廣泛和強烈的NUP62免疫反應(yīng)性(圖6A,B,C）。21例嚴(yán)重CTE患者腦組織的NUP62水平明顯高于對照組(圖6D)。輕度CTE病例中NUP62與pTDP-43的共聚集程度有限，而重度CTE病例中NUP62和pTDP-43陽性包體在額葉皮質(zhì)的共聚集(箭頭)更為明顯(圖6E)。