巨噬細(xì)胞表型協(xié)調(diào)急性胰腺炎損傷后的炎癥和修復(fù)再生

急性胰腺炎 (AP) 是最常見的炎癥性胃腸道疾病之一，在小鼠和人類模型中似乎通過外分泌腺泡細(xì)胞的再生而恢復(fù)。巨噬細(xì)胞是由組織損傷引發(fā)的炎癥和組織再生反應(yīng)的重要驅(qū)動因素，包括感染、自身免疫性疾病、機械或毒性損傷以及其他原因。在組織損傷時，骨髓 (BM) 衍生的巨噬細(xì)胞和/或組織駐留巨噬細(xì)胞被激活并以促炎方式響應(yīng)局部環(huán)境，然后迅速轉(zhuǎn)變?yōu)閭谛迯?fù)表型。巨噬細(xì)胞的表型和作用已在急性和慢性胰腺炎中得到充分證明。然而，關(guān)于巨噬細(xì)胞如何調(diào)節(jié)損傷后的胰腺修復(fù)/再生，包括 ADM 和腺泡再分化，我們知之甚少。

今天講一篇關(guān)于巨噬細(xì)胞表型變化與AP炎癥相關(guān)的文章，該文章題名為：Macrophage phenotypic switch orchestrates the inflammation and repair/regeneration following acute pancreatitis injury，IF=5.737，一區(qū)雜志。
AP損傷后胰腺巨噬細(xì)胞的表型變化

A動物模型使用雨蛙素誘導(dǎo)，。為了研究AP后的修復(fù)/再生過程，用更高劑量的雨蛙素（100μg/kg，每小時10次）誘導(dǎo) AP，并在一周內(nèi)的不同時間點收集胰腺。接受雨蛙素誘導(dǎo)治療的AP小鼠在24小時后顯示出腺泡壞死和白細(xì)胞浸潤的組織學(xué)跡象以及血清淀粉酶升高。第3天出現(xiàn)典型的腺泡-導(dǎo)管化生 (ADM) 結(jié)構(gòu)，第7天左右迅速恢復(fù)正常腺泡。

為了檢測免疫細(xì)胞的比例，分離并分析了 AP 誘導(dǎo)后的胰腺白細(xì)胞。發(fā)炎的胰腺內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞（CD11b⁺F4/80⁺CD11c^-）。流式細(xì)胞術(shù)分析的胰腺巨噬細(xì)胞數(shù)量在第1天和第3天顯著增加。根據(jù) F4/80 水平，胰腺巨噬細(xì)胞從第 1 天到第 3 天逐漸成熟。巨噬細(xì)胞在組織中的積累以兩種方式發(fā)生：單核細(xì)胞的募集和駐留巨噬細(xì)胞的增殖。AP 急性炎癥期的大多數(shù)巨噬細(xì)胞來自單核細(xì)胞的浸潤。根據(jù)我們的研究結(jié)果，與第 1 天相比，第 3 天的胰腺巨噬細(xì)胞具有更高的增殖能力。這可能部分解釋了第 3 天巨噬細(xì)胞的增加。此外，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示 M2 樣巨噬細(xì)胞 (CD206 + IL4RA + )的百分比在第 1 天（急性炎癥期）下降并從第 3 天開始增加（ADM 階段），而這些 M2 樣巨噬細(xì)胞的數(shù)量在第 3 天達(dá)到峰值，然后迅速減少。此外，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)與免疫熒光分析一致，其中 F4/80 ⁺ CD206 ⁺細(xì)胞在第 3 天最豐富。

接下來，我們想知道這些 CCR2 +單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是否可以在胰腺損傷后重新編程為 M2 樣巨噬細(xì)胞。在植入和誘導(dǎo) AP 8 周后，我們發(fā)現(xiàn)第 3 天的增殖巨噬細(xì)胞 (Ki67 + ) 主要來自 CCR2 WT小鼠。與來自 CCR2 KO小鼠的巨噬細(xì)胞相比，來自 CCR2 WT小鼠的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的 CD206 和 IL4RA 表達(dá)水平。綜上所述，結(jié)果表明，ADM 階段的 M2 樣巨噬細(xì)胞主要來源于 CCR2 +單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞在 AP 早期募集。

巨噬細(xì)胞在 AP 恢復(fù)不同階段的不同作用

鑒于 AP 恢復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的表型變化，接下來試圖通過用脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞來檢查巨噬細(xì)胞在不同修復(fù)/再生階段的作用。首先，我們在急性炎癥反應(yīng)后（從第 1 天到第 2 天）立即消耗了胰腺巨噬細(xì)胞，并在第 3 天檢查了胰腺。如圖所示，第 3 天之前巨噬細(xì)胞的消耗可以在很大程度上減少導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，這表明巨噬細(xì)胞在ADM的形成。AP 損傷后第 3天巨噬細(xì)胞的消耗顯著延遲了胰腺修復(fù)。Ki67 +細(xì)胞在第3天達(dá)到峰值，并隨著胰腺恢復(fù)逐漸下降。與組織學(xué)結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)CN處理組的Ki67 +細(xì)胞從第 5 天到第 7 天大幅下降，但在 CL 處理組中沒有，表明 CL 處理小鼠的修復(fù)過程受損。

此外，流式細(xì)胞儀分析證實，第 7 天胰腺中CD11b + F4/80 + CD206 +巨噬細(xì)胞顯著減少，這與免疫熒光數(shù)據(jù)一致。在總 CD11b +單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，成熟巨噬細(xì)胞 (F4/80 + MHCII hi ) 減少，而未成熟巨噬細(xì)胞 (F4/80 mid MHCII - ) 在第 7 天增加，此時胰腺巨噬細(xì)胞在 ADM 階段（第 3 天）短暫消耗。F4/80 mid MHCII -巨噬細(xì)胞表達(dá)更高水平的 CCR2 和 TNFα，表明它們與炎癥單核細(xì)胞（CD11b + Ly6C hi CCR2 +）分化并可能導(dǎo)致組織損傷。上述結(jié)果表明，ADM期胰腺巨噬細(xì)胞的耗竭（以M2樣表型為主），將觸發(fā)炎性單核細(xì)胞再次流入胰腺，從而在第7天造成組織損傷。

再生胰腺中胰腺巨噬細(xì)胞的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組譜

為了進一步了解 AP 恢復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的表型和功能，分離出胰腺巨噬細(xì)胞用于 RNA-seq 分析。顯著性差異表達(dá)基因繪制熱圖。為了評估這些基因簇的功能，使用網(wǎng)絡(luò)工具 DAVID Gene Ontology (GO) 進行了功能注釋分析。值得注意的是，在急性炎癥期（簇32，D1 特征簇）高度表達(dá)的基因特別富集炎癥反應(yīng)和 CCR2 依賴性趨化性。簇 25 和 27 包含在 ADM 階段（第 3 天）高表達(dá)的基因，具有不同的表達(dá)模式和功能，表明該階段的巨噬細(xì)胞異質(zhì)性。例如，與ECM-受體相互作用和PI3K-AKT信號通路相關(guān)的基因在簇27中富集，而與細(xì)胞周期相關(guān)的基因在簇25中富集。

巨噬細(xì)胞中 PI3K-AKT 激活促進 ADM 期后炎癥消退

基于 RNA-seq 數(shù)據(jù)，PI3K-AKT 信號在 ADM 期間在巨噬細(xì)胞中顯著富集。當(dāng)觀察PI3K-AKT 通路中這些升高的基因時，發(fā)現(xiàn)80%的基因與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)-受體相互作用、生長因子/細(xì)胞因子-受體相互作用有關(guān)，表明它們參與了巨噬細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間的串?dāng)_。同時，在第 3 天在 CD11b + F4/80 + CD206 +胰腺巨噬細(xì)胞中觀察到更高的 AKT 激活。在ADM 階段抑制巨噬細(xì)胞的 PI3K-AKT 激活時，胰腺修復(fù)/再生明顯受到阻礙。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)胰腺中 M2 樣巨噬細(xì)胞（CD11b + F4/80 + CD206 +）的數(shù)量變化較小，而未成熟巨噬細(xì)胞（CD11b + F4/80 mid）、炎性單核細(xì)胞（CD11b + Ly6C hi ) 和中性粒細(xì)胞 (CD11b + Ly6G + ) 顯著升高?？傊?，阻斷胰腺巨噬細(xì)胞中的 PI3K-AKT 信號將觸發(fā)促炎反應(yīng)和組織損傷，表明這些巨噬細(xì)胞在 ADM 階段（第 3 天）具有抗炎或促消退表型。

Il4ra缺陷小鼠的M2 樣巨噬細(xì)胞減少和再生失調(diào)

       為了探索再生過程中胰腺巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)機制，我們進行了基因集富集分析 (GSEA) 以比較第 3 天和第 1 天巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜。巨噬細(xì)胞的 M2 激活和 IL4 刺激特征從第 3 天開始富含巨噬細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IL-4和IL-13分別提高在第1天，和表達(dá)Il4ra自第1天升高，達(dá)到峰值在第3天。為了進一步確定受體和配體的細(xì)胞來源，在 AP 損傷后一天從胰腺中分離并比較了 CD45.2 +和 CD45.2 -細(xì)胞，有趣的是，Il4ra1被顯性免疫細(xì)胞上表達(dá)（CD45.2 +），而IL4和IL13中主要表達(dá)于實質(zhì)細(xì)胞（CD45.2 - ）。此外，通過使用Il4ra 缺陷小鼠，我們證明了 IL4Rα 信號在 AP 損傷后胰腺修復(fù)/再生過程中介導(dǎo)了 M2 巨噬細(xì)胞的極化。值得注意的是，與它們的對應(yīng)物相比，來自Il4ra -/-小鼠的胰腺在第 3 天和第 5 天具有更多的 ADM 結(jié)構(gòu)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明 IL4/IL4Rα 軸是 AP 恢復(fù)過程中胰腺巨噬細(xì)胞 M2 極化所必需的，發(fā)揮抗炎功能來控制 ADM 形成的程度。

PGE2 增強 IL4Rα 信號以增強巨噬細(xì)胞的 M2 激活

巨噬細(xì)胞能夠響應(yīng)可變的局部微環(huán)境信號從一種功能表型切換到另一種功能表型。除了經(jīng)典的信號級聯(lián)（例如，IL4/IL4Rα），巨噬細(xì)胞還可以整合由細(xì)胞外刺激觸發(fā)的代謝線索，以激活它們的 M2表型。在這里，我們想知道 PGE2 是否也參與了 AP 損傷后胰腺巨噬細(xì)胞的 M2 極化。為此，我們首先檢查了 AP 損傷后 PGE2 的動態(tài)表達(dá)。COX1 和 COX2 是產(chǎn)生前列腺素的兩種關(guān)鍵酶。在這里我們發(fā)現(xiàn)Ptgs2 (COX2)的表達(dá)在第 3 天達(dá)到峰值，而Ptgs1 (COX1)的表達(dá)在第 1 天下降并在第 3 天回到基礎(chǔ)水平。一致地，免疫熒光分析顯示 PGE2 在第 3 天升高，并在第 5 天迅速恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。值得注意的是，PGE2在第 3 天主要與導(dǎo)管樣細(xì)胞（CK19 +細(xì)胞）共表達(dá)，以及部分與巨噬細(xì)胞（F4/80 +細(xì)胞）共表達(dá)。此外，根據(jù)我們的 RNA-seq 數(shù)據(jù)和流式細(xì)胞術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中 COX2 的表達(dá)也在第 3 天達(dá)到峰值。更有趣的是，與 IL4Rα -巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，IL4Rα +巨噬細(xì)胞表達(dá)了更高水平的 COX2。

為了研究 PGE2 是否有助于 M2 活化，來自野生型 (WT) 和Il4ra -/-小鼠的BM 衍生巨噬細(xì)胞 (BMDM)在體外與 PGE2 一起經(jīng)受 IL4/IL13。PGE2 單獨不影響 M2 激活，但大大增強了 IL4/IL13 觸發(fā)的 M2 激活。更有趣的是，IL4/IL13 促進了巨噬細(xì)胞中ptgs2 的表達(dá)，在 PGE2 的存在下可以進一步升高。PGE2 通過與稱為 E-前列腺素 (EP) 1-4 受體的 4 種不同 G 偶聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮作用。不同受體的亞型決定了不同細(xì)胞類型的特定生理反應(yīng)。通過使用特定的 EP 抑制劑，我們確定 PGE2 促進 M2 極化主要由 EP2 受體介導(dǎo)。此外，PGE2 可以促進 IL4Rα 表達(dá)，從而增強 IL4/IL4Rα 信號傳導(dǎo)。在 ADM 階段（第 2 天）之前抑制 PGE2 合成在很大程度上降低了 M2 激活并在第 3 天增加了胰腺中的 ADM 結(jié)構(gòu)?？傊?，這些結(jié)果表明導(dǎo)管樣細(xì)胞和胰腺巨噬細(xì)胞在第 3 天釋放的 PGE2 增強了 M2 活化，并限制了再生胰腺中 ADM 的形成。