腫瘤的自我促進——外泌體miR-934誘導巨噬細胞M2極化促進CRC肝轉移

越來越多的證據表明腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和外泌體在轉移前niche（生態(tài)位）形成中發(fā)揮重要作用。TAMs是轉移前生態(tài)位形成和結直腸癌肝轉移(CRLM)的基礎。然而，腫瘤來源的外泌體miRNAs與TAMs相互作用的分子機制仍然很大程度上未知。本研究發(fā)現腫瘤來源外泌體miR-934可以誘導巨噬細胞M2極化，進而促進CRC的肝轉移。該文于2020年11月發(fā)表在《Journal of Hematology and Oncology》IF：11.059期刊上。

技術路線

主要實驗結果

1、miR-934表達升高與CRLM進展及預后不良呈正相關

為了揭示參與CRLM的miRNA，作者基于TCGA數據庫比較了CRC的1期腫瘤和4期腫瘤的miRNA表達譜，發(fā)現miR-934是在4期腫瘤中高表達差異表達最顯著的miRNA（Fig. 1a, b）。此外，作者將110個CRC組織按有無肝轉移分為兩組，發(fā)現肝轉移組與未轉移組相比，組織和血清miR-934表達上調（Fig. 1c, d）。接下來，為了研究miR-934在CRLM進展中的作用，使用ISH比較了miR-934在包含308個CRC樣本的組織芯片(TMA)中的表達，與正常粘膜組織相比，CRC組織中miR-934的表達明顯上調;miR-934表達增加與T分期、M分期、晚期AJCC分期和腫瘤復發(fā)呈正相關，尤其是在肝轉移的病例中（Fig. 1e）。以上數據提示，miR-934異常高表達與結直腸癌腫瘤進展及肝轉移顯著相關。生存分析顯示，與miR-934表達較低的患者相比，miR-934表達較高的患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)較低（Fig. 1f, g）。因此，在CRLM患者中，miR-934高表達與CRLM進展和預后不良呈正相關。

圖1 miR-934表達升高與CRLM進展及預后不良呈正相關

2、miR-934存在于CRC細胞衍生的外泌體中

miR-934在HCT-8和LoVo的CM中的表達顯著高于其它細胞（Fig. 2a）。隨后，研究發(fā)現HCT-8和LoVo的CM中miR-934的表達顯著高于細胞核和細胞質（Fig. 2b, c）。并且，miR-934在CM中的表達不隨RNase A的處理而改變，而隨RNase A+Triton X-100的處理顯著下降（Fig. 2d），這表明細胞外的miR-934被膜包裹，而不是直接分泌。因此，推測miR-934可能是被外泌體傳輸。電鏡和納米顆粒追蹤分析表明，miR-934表達水平較高的CRC細胞分泌的外泌體比miR-934表達水平較低的CRC細胞分泌的外泌體更多（Fig. 2e, f）。各組外泌體標志物CD9，ALIX，TSG101均被WB檢測到（Fig. 2g）。為了闡明miR-934是否主要來源于CRC細胞的外泌體，使用GW4869抑制CRC細胞的外泌體分泌，發(fā)現miR-934在CRC細胞來源的外泌體中的表達水平明顯高于外泌體耗盡的CRC細胞（Fig. 2h）。此外，采用qPCR分析miR-934在總CM、外泌體耗盡CM(超離心耗竭)和外泌體中的表達，結果顯示，miR-934在總CM或外泌體中的表達顯著高于外泌體缺失的CM（Fig. 2i）。此外，使用qPCR研究了上述四種CRC細胞系的外泌體中miR-934的表達，發(fā)現外泌體中miR-934的表達模式與CRC細胞CM中的表達模式一致（Fig. 2j）。以上結果表明miR-934主要包裹在CRC細胞來源的外泌體中。

圖2 miR-934存在于CRC細胞衍生的外泌體中

3、CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導巨噬細胞M2極化

為了探索miR-934促進CRLM的分子和細胞基礎，通過Cytoscape軟件注釋了TCGA cohort中191個miR-934相關基因的細胞功能，發(fā)現miR-934廣泛參與多種炎癥反應，提示miR-934可能參與了CRC免疫微環(huán)境（Fig. 3a）。然后發(fā)現miR-934與巨噬細胞的基因信號特異性相關（Fig. 3b）。為了研究在CRLM中TAM的浸潤與miR-934之間的相關性，我們在原發(fā)性結直腸癌組織和CRLM組織樣本中采用免疫組化染色檢測TAM標記CD163。如圖3c所示，在CRLM組織中CD163+ TAM浸潤豐富的區(qū)域觀察到miR-934表達升高。

將THP-1細胞與PMA孵育，誘導分化為M0巨噬細胞，M0巨噬細胞具有適當的貼壁形態(tài)和巨噬細胞標志物CD68的高表達（Fig. 3d）。接下來，研究了CRC細胞來源的外泌體對巨噬細胞M2極化的影響。如Fig. 3e所示，當與巨噬細胞共培養(yǎng)時，標記有DiO(綠色)的CRC細胞來源的外泌體被未染色的巨噬細胞內化。相比于低表達miR-934的細胞的外泌體孵育的巨噬細胞或PBS孵育的細胞，M2標記物 (CD206, arginase-1, IL10和CD163)的表達在高表達miR-934的CRC細胞的外泌體孵育的巨噬細胞中顯著增加，而M1標記物(iNOS和IL-1β)幾乎無差異（Fig. 3f, g）。

為了確定CRC細胞來源的外泌體miR-934是否誘導巨噬細胞的M2極化，首先生成了miR-934 mimics和anti-miR-934來過表達或抑制miR-934的表達。與對照組相比，轉染miR-934 mimics的巨噬細胞M2標記物(CD163、CD206、arginase-1和IL10)的表達明顯增加（Fig. 3h, i）。此外，用anti-miR-934、miR-934 mimics或其陰性對照載體轉染HCT-8和HT29細胞，提取其外泌體并添加到PMA處理的THP-1細胞中。結果顯示，轉染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細胞的外泌體中M2標記物(CD206、arginase-1、IL10和CD163)在PMA處理的THP-1細胞中表達明顯低于或高于載體對照組（Fig. 3j, k）。綜上所述，證實CRC細胞來源的外泌體miR-934可以誘導巨噬細胞M2極化。

圖3 CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導巨噬細胞M2極化

4、hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細胞轉移中發(fā)揮作用

據報道，外泌體RNA的分泌需要一種特定的RNA結合蛋白來轉運。通過RNA pull-down分析和質譜分析，鑒定了三種可能參與miR-934轉運的RNA結合蛋白，并發(fā)現敲除hnRNPA2B1可以降低外泌體miR-934的表達（Fig. 4a, b）。hnRNPA2B1是一種RNA結合蛋白，通過與特定基序GGAG/CCCU結合，參與miRNAs的運輸和轉錄后調控。特別是，由于miR-934序列中有兩個GGAG基序，我們推測hnRNPA2B1可能通過與GGAG序列結合，介導miR-934包裝成外泌體的過程。此外，miRNA pull-down分析顯示，在細胞質和外泌體中，miR-934和hnRNPA2B1之間存在顯著的結合關系，然而，突變miR-934的結合序列(GGAG)可削弱這種結合（Fig. 4c）。RNA免疫沉淀分析進一步證明，無論是在CRC細胞及其外泌體裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗體組中比在anti-IgG抗體組中更顯著富集（Fig. 4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌體miR-934從HCT8和LoVo細胞轉移到巨噬細胞的過程（Fig. 4e）。因此，這些結果證實hnRNPA2B1可以通過與miR-934的GGAG序列結合，介導miR-934包裝到CRC細胞外泌體中，并將外泌體miR-934轉移到巨噬細胞中。

圖4 hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細胞轉移中發(fā)揮作用

5、外泌體miR-934通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路誘導巨噬細胞M2極化

進一步探索腫瘤來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化的機制。miR-934序列與PTEN的3 ' -UTR序列存在比對，提示miR-934可能靶向PTEN誘導M2巨噬細胞極化（Fig. 5a）。如Fig.5b所示，將miR-934 mimics或anti-miR-934及其控制載體轉染到PMA處理的THP-1細胞中，發(fā)現分別轉染miR-934 mimics或anti-miR-934和PTEN野生型結合位點組中PTEN的3’-UTR熒光素酶活性顯著降低或升高（Fig. 5b）。有趣的是，當細胞與轉染了anti-miR-934、miR-934 mimics或其對照載體的HCT-8或HT29細胞的外泌體共培養(yǎng)時，熒光素酶活性模式顯示出與上述趨勢相同（Fig. 5c）。此外，PMA處理的THP-1細胞轉染miR-934 mimics或anti-miR-934，與各自的對照細胞相比，分別在mRNA和蛋白水平下調或上調了PTEN的表達（Fig. 5d）。類似的，分別用轉染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細胞的外泌體孵育PMA處理的THP-1細胞，結果發(fā)現PTEN，PI3K/AKT的表達明顯高于或低于各自的對照組（Fig. 5e, f）。這些表明在PMA處理的THP-1細胞中，外泌體來源的miR-934可以通過靶向其3 ' -UTR和激活PI3K/AKT通路來下調PTEN的表達。

IL-3/IL-4能誘導M2巨噬細胞極化，預先用50ng /mL IL-3/IL-4處理THP-1細胞3天，驗證anti-miR-934對M2巨噬細胞極化的影響。結果顯示PTEN過表達部分減弱了miR-934和HCT-8細胞來源外泌體對M2標記物(CD206, arginase-1和IL10)表達的增強作用，而PTEN的沉默則相應地逆轉了anti-miR-934對M2標記物表達的衰減效應（Fig. 5g, i）。流式細胞術檢測M2巨噬細胞標志物CD163在PMA處理的THP-1細胞中的表達，結果與上述結果一致（Fig. 5j）?？傊?，研究結果表明，miR-934增強了CRC細胞來源的外泌體對M2巨噬細胞極化誘導的增強作用，而anti-miR-934減弱了其增強作用。

PTEN是一種腫瘤抑制因子，調節(jié)多種細胞功能，包括細胞增殖和分化，PI3K/AKT信號通路是PTEN通過其磷酸酶活性靶向的最重要通路之一。因此，推測PI3K/AKT信號通路可能參與CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化。WB結果顯示過表達PTEN可以部分減弱miR-934和HCT-8細胞源外泌體對p-AKT和p-PI3K表達的增強作用，而沉默PTEN則相反（Fig. 5k）。更重要的是，當與HCT-8細胞來源的外泌體和PI3K抑制劑(LY294002)共培養(yǎng)時，PMA處理的THP-1細胞中p-AKT和M2標記物(CD206、arginase-1和CD163)的表達下調（Fig. 5l, m）。綜上所述，CRC細胞來源的外泌體miR-934可以通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路誘導M2巨噬細胞極化。

圖5外泌體miR-934通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路誘導巨噬細胞M2極化

6、CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化促進CRLM

將弱轉移的CRC細胞系SW480和RKO與miR-934 mimics預處理的THP-1細胞的CM共培養(yǎng)。結果顯示，無論是體內還是體外，侵襲和轉移能力都隨著miR-934 mimics外泌體處理而升高，隨著anti-miR-934外泌體處理而下降（Fig. 6c–g）。這些結果表明，CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化可以增強CRC細胞的侵襲和肝轉移能力。

圖6 CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化促進CRLM

7、CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化，通過激活CRC細胞中的CXCL13/CXCR5軸促進CRLM

用HCT-8細胞來源的外泌體與陰性對照處理或PMA預處理的THP-1細胞孵育，分析趨化因子水平。如Fig.7a所示，CXCL13、IL-10和CCL22的表達水平遠遠高于其他趨化因子的水平。然后，PMA-pretreated THP-1細胞轉染miR-934 mimics或NC，ELISA表明CXCL13的表達顯著增加(大約10倍)而CCL22和IL - 10(二至三倍)，這表明CXCL13可能在CRLM的進展扮演了一個重要的角色（Fig. 7b）。此外，結果顯示，過表達miR-934或下調miR-934可部分增強或減弱HT29/HCT8細胞來源外泌體對M2巨噬細胞分泌CXCL13的增強作用（Fig. 7c）。

因為CXCL13是一種趨化劑，可以促進表達CXCR5的細胞趨化，使用IHC染色評估其在CRC中的表達，結果顯示CXCR-5在結直腸癌組織中的染色強于正常組織，說明M2極化巨噬細胞分泌的CXCL13主要作用于CRC細胞（Fig. 7d）。PMA預處理后的THP-1細胞轉染miR-934 mimics，并與加入anti-CXCL13抗體或IgG的SW480細胞或RKO細胞共培養(yǎng)。此外，上述TPH-1細胞液與敲除CXCR5的細胞共培養(yǎng)。體外transwell實驗顯示，在與miR-934過表達PMA處理的THP-1細胞的CM共培養(yǎng)組中，anti-CXCL13抗體抑制了CRC細胞的遷移和侵襲；轉染了shCXCR5的SW480和RKO細胞與miR-934過表達PMA處理的THP-1細胞共培養(yǎng)時，遷移和侵襲能力降低（Fig. 7e, f）。此外，小鼠體內肝轉移檢測表明，與對照組相比，用anti-CXCL13抗體或敲除CXCR5的CRC細胞的肝轉移菌落減少（Fig. 7g–i）。

圖7 CRC細胞來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化，通過激活CRC細胞中的CXCL13/CXCR5軸促進CRLM

8、CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)路在CRLM期間介導M2巨噬細胞和CRC細胞之間的相互作用

如Fig. 8a所示，WB顯示，與對照組相比，SW480和RKO細胞中，CXCL13促進p65磷酸化，NFκB、MMP2和MMP9的表達上調而IκBα的表達下調。CXCR5表達下調可部分減弱CXCL13的增強作用。此外，PMA處理的THP-1細胞用miR-934 mimics預處理，然后與SW480細胞或RKO細胞與anti-CXCL13抗體共培養(yǎng)，或與shCXCR5共培養(yǎng)。我們發(fā)現CRC細胞中的anti-CXCL13抗體或CXCR5敲低可以抑制miR-934過表達誘導的NFκB信號通路的活化（Fig. 8b）。值得注意的是，helenalin抑制NFκB/p65信號后，SW480和RKO細胞中miR-934、MMP2和MMP9的表達顯著低于對照組（Fig. 8c），這表明miR-934也可能通過正反饋回路被NFκB/p65信號正調控。

由于p65轉位到細胞核并促進其靶向基因的轉錄，假設NFκB/p65信號通路的激活可通過p65的轉錄活性上調miR-934表達。在p65和miR-934啟動子之間發(fā)現了5個潛在的轉錄結合區(qū)域和2個特異性結合位點（Fig. 8d）。隨后，用miR-934啟動子中含有p65結合區(qū)域的載體轉染SW480和RKO細胞；ChIP實驗證明p65對miR-934的轉錄在-2002和-1500 bp（區(qū)域1）之間的區(qū)域內顯著增高，在其他四個結合區(qū)域中未觀察到明顯變化（Fig. 8e）。這些數據表明，區(qū)域1可能在調節(jié)CRC細胞中p65介導的miR-934轉錄誘導中起關鍵作用。熒光素酶報告基因檢測證實p65對SW480和RKO細胞中miR-934啟動子的轉錄影響（Fig. 8f）。作者發(fā)現只有突變結合位點1可以下調p65的熒光素酶報告基因活性，抑制miR-934的轉錄表達，這證明p65可以通過結合位點1正向直接調節(jié)miR-934的表達(Fig. 8f)。此外，作者證明了SW480和RKO細胞中的突變結合位點1可以消除CXCL13的促進作用和NFκB/p65信號對miR-934表達的抑制作用(Fig. 8g,h)。綜上所述，這些結果證明CXCL13/CXCR5/NFκB/p65信號通路促進CRC細胞中miR-934的轉錄，形成一個正反饋回路，參與持續(xù)的M2巨噬細胞極化和CRC細胞的侵襲和轉移。

圖8 CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)介導M2巨噬細胞與CRC細胞之間的相互作用CRLM

總之，如Fig. 9，CRC來源的外泌體miR-934可通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路誘導M2巨噬細胞極化。此外，外泌體miR-934極化的M2巨噬細胞可以通過CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR934正反饋環(huán)促進CRLM。因此，研究闡明了促進腫瘤細胞和TAMs相互作用的CRLM的新分子機制，這將有助于開發(fā)CRLM的有效預防和治療策略。更重要的是，血清外泌體中miR-934高表達與CRLM相關，提示其可能是未來液體活檢和預測CRLM風險的一個有前景的生物標志物。此外，靶向外泌體miR-934介導的腫瘤細胞與TAMs之間的串擾可能為CRLM的治療提供新策略。

圖9 圖形摘要

參考文獻：

Zhao Senlin., Mi Yushuai., Guan Bingjie., Zheng Binbin., Wei Ping., Gu Yanzi., Zhang Zhengxiang., Cai Sanjun., Xu Ye., Li Xinxiang., He Xuefeng., Zhong Xinyang., Li Guichao., Chen Zhiyu., Li Dawei.(2020). Tumor-derived exosomal miR-934 induces macrophage M2 polarization to promote liver metastasis of colorectal cancer. J Hematol Oncol, 13(1), 156. doi:10.1186/s13045-020-00991-2