與奧沙利鉑耐藥相關(guān)外泌體miR-208b促進CRC的Treg擴增

奧沙利鉑耐藥是結(jié)直腸癌(CRC)患者治療中的一個挑戰(zhàn)。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)以其免疫抑制作用而聞名，靶向Treg是提高化療敏感性的有效途徑。Treg是一種提高化學敏感性的有效方法。外泌體遞送的miRNA被用作預測化療敏感性的潛在生物標志物。然而，Treg和外泌體miRNAs之間的關(guān)系仍然很大程度上是未知的。本研究結(jié)果表明，腫瘤分泌的miR-208b通過靶向PDCD4促進Treg擴增，這可能與CRC中奧沙利鉑化療敏感性的降低有關(guān)本。這些發(fā)現(xiàn)突出了外泌體miR-208b作為奧沙利鉑治療反應(yīng)的預測生物標志物的潛在作用，并且它們是免疫治療的新靶點。本研究于2021年4月發(fā)表于《Molecular Therapy》IF: 8.986期刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、循環(huán)miR-208b是CRC中FOLFOX化療敏感性的一種很有前途的生物標志物

如圖1所示，作者設(shè)計了一項多期研究，以確定新的血清miRNAs作為預測和監(jiān)測奧沙利鉑聯(lián)合亞葉酸和5-FU（FOLFOX）化療反應(yīng)的替代標志物。

圖1描述實驗設(shè)計的流程圖

作者檢測了69個化療敏感和47個化療不敏感患者的血漿中miR-208b表達，結(jié)果顯示與未響應(yīng)組相比，miR-208b的表達水平在響應(yīng)組顯著下調(diào)（圖2A-B）。同時檢測了血清癌胚抗原(CEA)水平，血清miR-208b的曲線下面積(AUC)與血清CEA的AUC相比，優(yōu)于血清CEA水平。在化療響應(yīng)組，在化療前miR-208b的表達高于化療后，而在未響應(yīng)組，化療前低于化療后水平（圖2C）。生存分析顯示，無進展生存期化療響應(yīng)組顯著高于未響應(yīng)組，miR-208b低表達組顯著高于高表達組（圖2D）。這些結(jié)果表明miR-208b可作為預測CRC中FOLFOX化療敏感性的非侵襲性標志物。

圖2循環(huán)miR-208b是CRC中FOLFOX化療敏感性的很有前途的生物標志物

2、miR-208b由結(jié)腸癌細胞以外泌體的方式分泌

隨后，作者探究了miR-208b的存在方式是否由外泌體介導。分離鑒定了3株CRC細胞系的外泌體，并檢測了其中miR-208b的表達。外泌體中miR-208b的表達模式和在細胞中的模式一致，在SW480-OXA顯著高于SW480顯著高于NCM460。這些結(jié)果表明CRC中miR-208b的是以外泌體的模式分泌，這可能和順鉑化療敏感性有關(guān)。

圖3 miR-208b由結(jié)腸癌細胞以外泌體的方式分泌

3、SW480細胞分泌的外泌體miR-208b促進Treg擴增

前人研究表明順鉑會影響腫瘤免疫微環(huán)境。MiRNA可能通過促進Treg擴增誘導免疫侵襲。因此，作者探究了CRC分泌外泌體miR-208b對T細胞分化的影響。使用siRNA去除miR-208b，然后收集外泌體，將含有不同水平miR-208b的外泌體與原代CD4+ T細胞共培養(yǎng)（圖4A-B）。6h后，受體CD4+ T細胞中miR-208b顯著增加，尤其是SW480-OXA組，而外泌體miR-208b缺失組則沒有顯著改變，表明CD4+ T細胞中miR-208b是由外泌體傳輸（圖4C-D）。此外，SW480和SW480-OXA來源外泌體處理組的CD4+CD25highFoxp3+ Tregs細胞數(shù)顯著增加，而外泌體miR-208b缺失對其陽性細胞數(shù)則沒有明顯影響。表明外泌體miR-208b促進Treg擴增。

圖4 SW480細胞分泌的外泌體miR-208b促進Treg擴增

4、miR-208b直接靶向和抑制CD4+ T 細胞中PDCD4的表達

為了進一步探究miR-208b的分子機制，探究了其下游靶基因機制，使用生信預測了其靶基因，最終挑選到PDCD4（圖5A）。熒光素酶進一步證實了miR-208b和PDCD4之間的結(jié)合（圖5C-D）。研究發(fā)現(xiàn)，T細胞中PDCD4的表達在SW480外泌體處理組顯著下降，而這個抑制作用在SW480-OXA組更加明顯，PCD表達在miR-208b缺失組則顯著升高（圖5E）。此外，加入miR-208b mimics后，PDCD4蛋白顯著降低，而抑制miR-208b后，PDCD4蛋白的表達相對增強,此外，PDCD4在mRNA水平的表達沒有明顯變化（圖5F）。然后，評估了miR-208b對CD4+ T細胞擴增的影響。研究表明，轉(zhuǎn)染miR-208b mimics顯著增強了Treg的擴增，而抑制miR-208b水平則抑制了Treg的擴增（圖5G-H）。這些結(jié)果表明miR-208b直接靶向抑制PDCD4的表達，導致Treg分化。

圖5 miR-208b通過直接靶向和抑制PDCD4的表達來促進Treg的擴增

5、確認PDCD4在調(diào)節(jié)Treg擴增中的作用

隨后探究了PDCD4在調(diào)節(jié)Treg擴增中的作用。如圖A-C所示，成功構(gòu)建了PDCD4的過表達和干擾表達細胞系。與對照組相比，PDCD4過表達顯著降低了Treg細胞的擴增率，而干擾其表達則顯著提高了Treg細胞的擴增率。表明PDCD4是負調(diào)節(jié)Treg細胞擴增的關(guān)鍵基因。

圖6 PDCD4與Treg擴增密切相關(guān)

6、腫瘤來源外泌體miR-208b影響體內(nèi)化療效果和腫瘤生長

隨后作者探究了腫瘤來源外泌體miR-208b體內(nèi)對化療效果和腫瘤生長的影響。用慢病毒轉(zhuǎn)染CT26細胞產(chǎn)生miR-208b過表達和miR-208b敲低細胞系。動物實驗設(shè)計示意圖如圖7A所示，實驗采用6組(每組10只小鼠)，其中3組使用奧沙利鉑，BALB/c小鼠植入CT26細胞，建立腫瘤植入模型。如圖7B-7D所示，miR-208b-OE組腫瘤生長速度較快，而中miR-208-KD組腫瘤生長明顯慢于對照組。

從各組小鼠中分離出外周血CD4+ T細胞，結(jié)果顯示miR-208b-OE組中PDCD4的顯著下調(diào)，miR-208-KD組的結(jié)果則相反(圖7E和7F)。然而，在PDCD4 mRNA水平上沒有觀察到差異(圖7G)。從血清中分離出外泌體，檢測miR-208b水平(圖7H)。如預期的，miR-208b在miR-208b-OE組中顯著升高，而miR-208b-KD組中miR-208b水平下降 (圖7I)。這些結(jié)果表明，腫瘤分泌的miR-208b在體內(nèi)可以充分地傳遞到CD4+ T細胞中，抑制PDCD4的表達。此外，這種現(xiàn)象在奧沙利鉑治療組更加顯著(miR-208b-OE + OXA和miR-208b-KD+ OXA)。

圖7 miR-208b通過促進Treg在體內(nèi)的擴增來促進腫瘤生長

接下來，測定了分泌的miR-208b對體內(nèi)Treg和存活的影響，如圖8A-B所示，CD4+- CD25+ Foxp3+ Treg在外周血和脾臟分離的總CD4+ T細胞群中的比例在miR-208b-OE組和miR-208b-OE + OXA組顯著升高，而在miR-208b-KD和miR-208b-KD + OXA顯著下降。與此一致，miR-208b低表達組的生存率也顯著高于高表達組（圖8C）。綜上所述，這些結(jié)果表明，腫瘤分泌的miR208b增加了Treg的百分比，促進了腫瘤在體內(nèi)的生長。此外，奧沙利鉑在體內(nèi)可以通過miR-208b調(diào)控Tregs的數(shù)量，這與奧沙利鉑成分的化學敏感性有關(guān)。

圖8癌細胞分泌的miR-208b增加了體內(nèi)Treg的數(shù)量

參考文獻：

Ning et al., Exosomal miR-208b related with oxaliplatin resistance promotes Treg expansion in colorectal cancer, Molecular Therapy (2021), https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.04.028